Immunomodulyator metabolitlar o'sma mikromuhitining (TME) asosiy xususiyati hisoblanadi, ammo bir nechta istisnolardan tashqari, ularning kimligi deyarli noma'lumligicha qolmoqda. Bu yerda biz yuqori darajadagi seroz karsinoma (HGSC) bilan og'rigan bemorlarning o'smalari va assitlaridan olingan o'smalar va T hujayralarini tahlil qilib, ushbu turli TME bo'limlarining metabolomini aniqladik. Assitlar va o'sma hujayralari keng metabolit farqlariga ega. Assitlar bilan solishtirganda, o'sma infiltratsiya qiluvchi T hujayralari 1-metilnikotinamid (MNA) ga sezilarli darajada boyitilgan. T hujayralarida MNA darajasi yuqori bo'lsa-da, nikotinamid N-metiltransferaza (S-adenosilmetionindan nikotinamidga metil guruhlarini o'tkazishni katalizlovchi ferment) ning ifodasi fibroblastlar va o'sma hujayralari bilan cheklangan. Funktsional jihatdan MNA T hujayralarini o'smani rag'batlantiruvchi sitokin o'sma nekrozi omili alfa sekretsiyasini keltirib chiqaradi. Shuning uchun, TME dan olingan MNA T hujayralarining immun regulyatsiyasiga hissa qo'shadi va inson saratonini davolash uchun potentsial immunoterapiya maqsadini ifodalaydi.
O'smadan olingan metabolitlar o'smalarga qarshi immunitetga chuqur inhibitiv ta'sir ko'rsatishi mumkin va tobora ko'proq dalillar shuni ko'rsatadiki, ular kasallikning rivojlanishi uchun asosiy harakatlantiruvchi kuch bo'lib xizmat qilishi mumkin (1). Warburg effektidan tashqari, so'nggi paytlarda o'sma hujayralarining metabolik holatini va uning o'sma mikromuhitining (TME) immun holati bilan bog'liqligini tavsiflash bo'yicha ishlar boshlandi. Sichqoncha modellari va inson T hujayralari bo'yicha tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, glutamin metabolizmi (2), oksidlovchi metabolizm (3) va glyukoza metabolizmi (4) turli immun hujayra kichik guruhlariga mustaqil ravishda ta'sir qilishi mumkin. Ushbu yo'llardagi bir nechta metabolitlar T hujayralarining o'smalarga qarshi funktsiyasini inhibe qiladi. Tetrahidrobiopterin (BH4) koenzimining blokadasi T hujayralarining ko'payishiga zarar etkazishi va organizmda BH4 ning ko'payishi CD4 va CD8 vositachiligidagi o'smalarga qarshi immunitetni kuchaytirishi mumkinligi isbotlangan. Bundan tashqari, kinureninning immunosupressiv ta'sirini BH4 ni yuborish orqali qutqarish mumkin (5). Izositrat dehidrogenaza (IDH) mutant glioblastomasida enantiometabolik (R)-2-gidroksiglutarat (R-2-HG) sekretsiyasi T hujayralarining faollashuvi, proliferatsiyasi va sitoliz faolligini inhibe qiladi (6). Yaqinda glikolizning qo'shimcha mahsuloti bo'lgan metilglioksal miyeloid kelib chiqishi bo'lgan supressor hujayralar tomonidan ishlab chiqarilishi va metilglioksalning T hujayralariga o'tkazilishi effektor T hujayralari funktsiyasini inhibe qilishi mumkinligi ko'rsatildi. Davolashda metilglioksalning neytrallanishi miyeloiddan olingan supressor hujayralar (MDSC) faolligini yengib o'tishi va sichqon modellarida nazorat nuqtalarini blokirovka qilish terapiyasini sinergik ravishda kuchaytirishi mumkin (7). Ushbu tadqiqotlar birgalikda TME dan olingan metabolitlarning T hujayralari funktsiyasi va faolligini tartibga solishdagi asosiy rolini ta'kidlaydi.
Tuxumdon saratonida T hujayralari disfunktsiyasi keng tarqalgan (8). Bu qisman gipoksiya va g'ayritabiiy o'sma qon tomir tizimiga xos bo'lgan metabolik xususiyatlarga bog'liq (9), bu esa glyukoza va triptofanning sut kislotasi va kinurenin kabi qo'shimcha mahsulotlarga aylanishiga olib keladi. Haddan tashqari hujayradan tashqari laktat interferon-γ (IFN-γ) ishlab chiqarishni kamaytiradi va miyelosupressiv kichik guruhlarning differentsiatsiyasini rag'batlantiradi (10, 11). Triptofanni iste'mol qilish T hujayralarining ko'payishini to'g'ridan-to'g'ri inhibe qiladi va T hujayra retseptorlari signalizatsiyasini inhibe qiladi (12-14). Ushbu kuzatuvlarga qaramay, in vitro sharoitida optimallashtirilgan muhit yordamida immun metabolizmi bilan bog'liq ko'plab ishlar amalga oshirildi yoki in vivo homologik sichqoncha modellari bilan cheklangan, ularning hech biri inson saratonining heterojenligini va fiziologik makro va mikro muhitni to'liq aks ettirmaydi.
Tuxumdon saratonining keng tarqalgan xususiyati qorin parda ortiga tarqalishi va assitlarning paydo bo'lishidir. Assitda hujayra suyuqligining to'planishi kasallikning rivojlangan bosqichi va yomon prognoz bilan bog'liq (15). Xabarlarga ko'ra, bu noyob bo'lim gipoksik bo'lib, qon tomir endotelial o'sish omili (VEGF) va indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO) ning yuqori darajasiga ega va T regulyator hujayralari va miyeloid inhibitor hujayralari tomonidan infiltratsiya qilinadi (15-18). Assitlarning metabolik muhiti o'smaning o'zidan farq qilishi mumkin, shuning uchun qorin parda bo'shlig'idagi T hujayralarining qayta dasturlanishi noaniq. Bundan tashqari, o'sma muhitida mavjud bo'lgan assitlar va metabolitlar o'rtasidagi asosiy farqlar va heterojenlik immun hujayralarining infiltratsiyasiga va ularning o'smalarga ta'sir qilishiga to'sqinlik qilishi mumkin va qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.
Ushbu muammolarni hal qilish uchun biz turli xil hujayra turlarini (shu jumladan CD4 + va CD8 + T hujayralarini), shuningdek, o'smalar ichida va ular orasidagi hujayralarni o'rganish uchun sezgir hujayra ajratish va suyuq xromatografiya tandem massa spektrometriyasi (LC-MS/MS) usulini ishlab chiqdik. Uning metabolitlari bemorning bir xil astsitlari va o'sma muhitidagi hujayralarni qamrab oladi. Biz ushbu usulni yuqori o'lchovli oqim sitometriyasi va bitta hujayrali RNK ketma-ketligi (scRNA-seq) bilan birgalikda ushbu asosiy populyatsiyalarning metabolik holatining yuqori aniqlikdagi portretini taqdim etish uchun qo'llaymiz. Ushbu usul o'sma T hujayralarida 1-metilnikotinamid (MNA) darajasining sezilarli darajada oshishini aniqladi va in vitro tajribalar MNA ning T hujayralari funktsiyasiga immunomodulyator ta'siri ilgari noma'lum ekanligini ko'rsatdi. Umuman olganda, bu usul o'smalar va immun hujayralari o'rtasidagi o'zaro metabolik o'zaro ta'sirlarni ochib beradi va immun regulyatsiya metabolitlari haqida noyob tushunchalar beradi, bu esa T hujayralariga asoslangan tuxumdon saratoni immunoterapiyasini davolash imkoniyatlari uchun foydali bo'lishi mumkin.
Biz glyukoza qabul qilinishini bir vaqtning o'zida aniqlash uchun yuqori o'lchovli oqim sitometriyasidan foydalandik [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglyukoza (2-NBDG) va mitoxondrial faollik [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) immun hujayralari va o'sma hujayralari populyatsiyasini ajratib turadigan yonma-yon tipik markerlardir (S2-jadval va S1A-rasm). Ushbu tahlil shuni ko'rsatdiki, T hujayralari bilan solishtirganda, assit va o'sma hujayralari glyukoza qabul qilish darajasi yuqori, ammo mitoxondrial faollikda kichikroq farqlarga ega. O'sma hujayralarining [CD45-EpCAM (EpCAM)+] o'rtacha glyukoza qabul qilishi T hujayralariga qaraganda uch-to'rt baravar, CD4 + T hujayralarining o'rtacha glyukoza qabul qilishi esa CD8 + T hujayralariga qaraganda 1,2 baravar ko'p, bu o'sma infiltratsiya qiluvchi limfotsitlar (TIL) bir xil TME da ham turli metabolik talablarga ega ekanligini ko'rsatadi (1A-rasm). Aksincha, o'sma hujayralaridagi mitoxondriyal faollik CD4 + T hujayralarinikiga o'xshash va ikkala hujayra turining mitoxondriyal faolligi CD8 + T hujayralarinikidan yuqori (1B-rasm). Umuman olganda, bu natijalar metabolik darajani ko'rsatadi. O'sma hujayralarining metabolik faolligi CD4 + T hujayralarinikidan yuqori va CD4 + T hujayralarining metabolik faolligi CD8 + T hujayralarinikidan yuqori. Hujayra turlari bo'yicha bu ta'sirlarga qaramay, CD4 + va CD8 + T hujayralarining metabolik holatida yoki ularning assitdagi nisbiy nisbatlarida o'smalar bilan solishtirganda izchil farq yo'q (1C-rasm). Aksincha, CD45-hujayra fraktsiyasida o'smadagi EpCAM+ hujayralarining nisbati assitlarga nisbatan oshdi (1D-rasm). Shuningdek, biz EpCAM+ va EpCAM-hujayra komponentlari o'rtasida aniq metabolik farqni kuzatdik. EpCAM+ (o'sma) hujayralari EpCAM-hujayralariga qaraganda yuqori glyukoza qabul qilish va mitoxondriyal faollikka ega, bu TMEdagi o'sma hujayralaridagi fibroblastlarning metabolik faolligidan ancha yuqori (1-rasm, E va F).
(A va B) Glyukoza qabul qilishning o'rtacha lyuminestsentsiya intensivligi (MFI) (2-NBDG) (A) va CD4 + T hujayralarining mitoxondrial faolligi (MitoTracker to'q qizil) (B) Assit va o'smadan olingan vakillik grafiklar (chapda) va jadval ma'lumotlari (o'ngda), CD8 + T hujayralari va EpCAM + CD45-o'sma hujayralari. (C) Assit va o'smadagi CD4 + va CD8 + hujayralarining (CD3 + T hujayralarining) nisbati. (D) Assit va o'smadagi (CD45−) EpCAM + o'sma hujayralarining ulushi. (E va F) EpCAM + CD45-o'sma va EpCAM-CD45-matritsali glyukoza qabul qilish (2-NBDG) (E) va mitoxondrial faollik (MitoTracker to'q qizil) (F) vakillik grafiklar (chapda) va jadval ma'lumotlari (o'ngda) Assitlar va o'sma hujayralari. (G) Oqim sitometriyasi yordamida CD25, CD137 va PD1 ifodasining vakillik grafiklari. (H va I) CD4 + T hujayralarida (H) va CD8 + T hujayralarida (I) CD25, CD137 va PD1 ifodasi. (J va K) CCR7 va CD45RO ifodasiga asoslangan sodda, markaziy xotira (Tcm), effektor (Teff) va effektor xotira (Tem) fenotiplari. Assit va o'smalarda CD4 + T hujayralarining (J) va CD8 + T hujayralarining (K) vakillik tasvirlari (chapda) va jadval ma'lumotlari (o'ngda). P qiymatlari juftlashgan t-test orqali aniqlanadi (*P<0.05, **P<0.01 va ***P<0.001). Chiziq mos keladigan bemorlarni ifodalaydi (n = 6). FMO, lyuminestsentsiya minus bir; MFI, o'rtacha lyuminestsentsiya intensivligi.
Keyingi tahlillar yuqori darajada aniqlangan T hujayralarining fenotipik holati o'rtasidagi boshqa muhim farqlarni aniqladi. O'smalarda faollashtirilgan (1-rasm, G dan I gacha) va effektor xotirasi (1-rasm, J va K) astsitlarga (CD3 + T hujayralarining nisbati) qaraganda ancha tez-tez uchraydi. Xuddi shunday, faollashtirish markerlari (CD25 va CD137) va kamayish markerlari [dasturlashtirilgan hujayra o'limi oqsili 1 (PD1)] ifodasi bo'yicha fenotipni tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, bu populyatsiyalarning metabolik xususiyatlari har xil bo'lsa-da (S1-rasm, B dan E gacha), ammo sodda, effektor yoki xotira kichik guruhlari o'rtasida doimiy ravishda sezilarli metabolik farqlar kuzatilmadi (S1-rasm, F dan I gacha). Bu natijalar hujayra fenotiplarini avtomatik ravishda belgilash uchun mashinani o'rganish usullaridan foydalanish orqali tasdiqlandi (21), bu esa bemorning astsitlarida ko'p sonli suyak iligi hujayralari (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) mavjudligini aniqladi (S2A-rasm). Aniqlangan barcha hujayra turlari orasida bu miyeloid hujayra populyatsiyasi eng yuqori glyukoza qabul qilish va mitoxondrial faollikni ko'rsatdi (S2-rasm, B dan G gacha). Ushbu natijalar HGSC bemorlarida assit va o'smalarda uchraydigan bir nechta hujayra turlari o'rtasidagi kuchli metabolik farqlarni ta'kidlaydi.
TIL ning metabonomik xususiyatlarini tushunishdagi asosiy qiyinchilik o'smalardan yetarli darajada tozalik, sifat va miqdorga ega T hujayralari namunalarini ajratib olish zaruratidir. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, oqim sitometriyasiga asoslangan saralash va boncuklarni boyitish usullari hujayra metabolitlari profillarida o'zgarishlarga olib kelishi mumkin (22-24). Ushbu muammoni bartaraf etish uchun biz LC-MS/MS yordamida tahlil qilishdan oldin jarrohlik yo'li bilan rezektsiya qilingan inson tuxumdon saratonidan TIL ni ajratib olish va ajratish uchun boncuklarni boyitish usulini optimallashtirdik (Materiallar va usullarga qarang; 2A-rasm). Ushbu protokolning metabolit o'zgarishlariga umumiy ta'sirini baholash uchun biz yuqoridagi boncuklarni ajratish bosqichidan keyin sog'lom donorlar tomonidan faollashtirilgan T hujayralarining metabolit profillarini boncuklar ajratilmagan, ammo muz ustida qolgan hujayralar bilan taqqosladik. Ushbu sifat nazorati tahlili shuni ko'rsatdiki, bu ikki holat o'rtasida yuqori korrelyatsiya mavjud (r = 0,77) va 86 ta metabolit guruhining texnik takrorlanishi yuqori takrorlanishga ega (2B-rasm). Shuning uchun, bu usullar hujayra turini boyitish jarayonidan o'tayotgan hujayralarda aniq metabolit tahlilini amalga oshirishi mumkin, shu bilan HGSCdagi o'ziga xos metabolitlarni aniqlash uchun birinchi yuqori aniqlikdagi platformani taqdim etadi va shu bilan odamlarga hujayra o'ziga xosligi Jinsiy metabolizm dasturini chuqurroq tushunishga imkon beradi.
(A) Magnit munchoqlarni boyitishning sxematik diagrammasi. LC-MS/MS yordamida tahlil qilishdan oldin, hujayralar ketma-ket uchta magnit munchoqlarni boyitish bosqichidan o'tadi yoki muz ustida qoladi. (B) Boyitish turining metabolitlar ko'pligiga ta'siri. Har bir boyitish turi uchun uchta o'lchovning o'rtacha qiymati ± SE. Kulrang chiziq 1:1 munosabatini ifodalaydi. O'q yorlig'ida ko'rsatilgan takroriy o'lchovlarning sinf ichidagi korrelyatsiyasi (ICC). NAD, nikotinamid adenin dinukleotidi. (C) Bemor metabolitlarini tahlil qilish ish jarayonining sxematik diagrammasi. Assitlar yoki o'smalar bemorlardan yig'iladi va kriyokonservatsiya qilinadi. Har bir namunaning kichik bir qismi oqim sitometriyasi yordamida tahlil qilindi, qolgan namunalar esa CD4+, CD8+ va CD45-hujayralar uchun uch bosqichli boyitishdan o'tkazildi. Bu hujayra fraktsiyalari LC-MS/MS yordamida tahlil qilindi. (D) Standartlashtirilgan metabolitlar ko'pligining issiqlik xaritasi. Dendrogram namunalar orasidagi Evklid masofalarining Ward klasterini ifodalaydi. (E) Namuna metabolit xaritasining asosiy komponent tahlili (PCA), har bir namunaning uchta nusxasini ko'rsatadi, bir xil bemordan olingan namunalar chiziq orqali bog'langan. (F) Bemorga bog'liq bo'lgan namunaning metabolit profilining PCA (ya'ni, qisman ortiqchalikdan foydalanish); namuna turi qavariq korpus bilan cheklangan. PC1, asosiy komponent 1; PC2, asosiy komponent 2.
Keyin, biz ushbu boyitish usulini oltita HGSC bemorining birlamchi astsitlari va o'smalarida CD4+, CD8+ va CD45-hujayra fraktsiyalaridagi 99 ta metabolitni tahlil qilish uchun qo'lladik (2C-rasm, S3A-rasm va S3 va S4-jadvallar). Qiziqish populyatsiyasi tirik hujayralarning asl katta namunasining 2% dan 70% gacha qismini tashkil qiladi va hujayralar ulushi bemorlar orasida juda katta farq qiladi. Boncuklarni ajratgandan so'ng, boyitilgan qiziqish fraksiyasi (CD4+, CD8+ yoki CD45-) o'rtacha namunadagi barcha tirik hujayralarning 85% dan ortig'ini tashkil qiladi. Ushbu boyitish usuli bizga inson o'sma to'qimasi metabolizmidan hujayra populyatsiyalarini tahlil qilish imkonini beradi, buni katta namunalardan amalga oshirish mumkin emas. Ushbu protokoldan foydalanib, biz l-kinurenin va adenozin, bu ikkita yaxshi tavsiflangan immunosupressiv metabolitlar o'sma T hujayralarida yoki o'sma hujayralarida ko'tarilganligini aniqladik (S3, B va C-rasmlar). Shuning uchun, bu natijalar bizning hujayra ajratish va massa spektrometriyasi texnologiyamizning bemor to'qimalarida biologik jihatdan muhim metabolitlarni topishdagi aniqligi va qobiliyatini namoyish etadi.
Bizning tahlilimiz bemorlar ichida va ular o'rtasida hujayra turlarining kuchli metabolik ajralishini ham aniqladi (2D-rasm va S4A-rasm). Xususan, boshqa bemorlar bilan solishtirganda, 70-bemor turli metabolik xususiyatlarni ko'rsatdi (2E-rasm va S4B-rasm), bu bemorlar o'rtasida sezilarli metabolik heterojenlik bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Shuni ta'kidlash kerakki, boshqa bemorlar bilan solishtirganda (1,2 dan 2 litrgacha; S1-jadval), 70-bemorda to'plangan assitlarning umumiy miqdori (80 ml) kamroq edi. Asosiy komponent tahlili paytida (masalan, qisman ortiqcha tahlildan foydalangan holda) bemorlar o'rtasidagi heterojenlikning nazorati hujayra turlari o'rtasida izchil o'zgarishlarni ko'rsatadi va hujayra turlari va/yoki mikro muhit metabolit profiliga ko'ra aniq birlashtirilgan (2F-rasm). Yagona metabolitlarni tahlil qilish bu ta'sirlarni ta'kidladi va hujayra turlari va mikro muhit o'rtasidagi sezilarli farqlarni aniqladi. Shuni ta'kidlash kerakki, kuzatilgan eng ekstremal farq odatda CD45-hujayralarda va o'simtaga infiltratsiya qiluvchi CD4+ va CD8+ hujayralarida boyitilgan MNA (3A-rasm). CD4 + hujayralari uchun bu ta'sir eng aniq ko'rinadi va CD8 + hujayralaridagi MNA ham atrof-muhitdan kuchli ta'sirlangan ko'rinadi. Biroq, bu muhim emas, chunki olti bemordan faqat uchtasi o'sma CD8 + ballari bo'yicha baholanishi mumkin. MNAdan tashqari, assit va o'smalardagi turli xil hujayralarda TILda yomon tavsiflangan boshqa metabolitlar ham turlicha boy (S3 va S4-rasmlar). Shuning uchun, bu ma'lumotlar keyingi tadqiqotlar uchun istiqbolli immunomodulyator metabolitlar to'plamini ochib beradi.
(A) Assit va o'smadan kelib chiqqan CD4+, CD8+ va CD45-hujayralarida MNA ning normallashtirilgan miqdori. Katakcha grafikida mediana (chiziq), kvartillararo diapazon (ramka menteşesi) va ma'lumotlar diapazoni kvartillararo diapazondan (ramka mo'ylovi) 1,5 baravargacha ko'rsatilgan. Bemor materiallari va usullarida tasvirlanganidek, P qiymatini aniqlash uchun bemorning limma qiymatidan foydalaning (*P<0,05 va **P<0,01). (B) MNA metabolizmining sxematik diagrammasi (60). Metabolitlar: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-gomosistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotidi. Fermentlar (yashil): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaza; SIRT, sirtuinlar; NAMPT, nikotinamid fosforiboziltransferaza; AOX1, aldegid oksidaza 1; NRK, nikotinamid ribosid kinaza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaza; Pnp1, purin nukleozid fosforilaza. (C) Assitlar (kulrang) va o'smaning scRNA-sekvensiyasining t-SNE (qizil; n = 3 bemor). (D) scRNA-sekvensiyasi yordamida aniqlangan turli hujayra populyatsiyalarida NNMT ifodasi. (E) SK-OV-3, inson embrion buyragi (HEK) 293T, T hujayralari va MNA bilan ishlov berilgan T hujayralarida NNMT va AOX1 ifodasi. Buklangan ifoda SK-OV-3 ga nisbatan ko'rsatilgan. SEM bilan ifoda naqshi ko'rsatilgan (n = 6 sog'lom donor). 35 dan yuqori Ct qiymatlari aniqlanmaydi (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, T hujayralari va 8mM MNA bilan ishlov berilgan T hujayralarida SLC22A1 va SLC22A2 ning ifodalanishi. Buklangan ifoda SK-OV-3 ga nisbatan ko'rsatilgan. SEM bilan ifodalanish shakli ko'rsatilgan (n = 6 sog'lom donor). 35 dan yuqori Ct qiymatlari aniqlanmaydi (UD). (G) MNA bilan 72 soatlik inkubatsiyadan so'ng faollashtirilgan sog'lom donor T hujayralarida hujayra MNA miqdori. SEM bilan ifodalanish shakli ko'rsatilgan (n = 4 sog'lom donor).
MNA metil guruhini S-adenosil-1-metionin (SAM) dan nikotinamid N-metiltransferaza (NNMT; 3B-rasm) orqali nikotinamidga (NA) o'tkazish orqali ishlab chiqariladi. NNMT turli xil inson saraton kasalliklarida ortiqcha ifodalanadi va proliferatsiya, invaziya va metastaz bilan bog'liq (25-27). TME dagi T hujayralarida MNA manbasini yaxshiroq tushunish uchun biz uchta HGSC bemorining astsit va o'smalarida hujayra turlari bo'yicha NNMT ifodasini tavsiflash uchun scRNA-seq dan foydalandik (S5-jadval). Taxminan 6500 hujayraning tahlili shuni ko'rsatdiki, astsit va o'sma muhitida NNMT ifodasi taxmin qilingan fibroblast va o'sma hujayralari populyatsiyalari bilan cheklangan (3-rasm, C va D). Shuni ta'kidlash kerakki, PTPRC (CD45 +) ni ifodalovchi biron bir populyatsiyada aniq NNMT ifodasi yo'q (3D-rasm va S5A-rasm), bu metabolit spektrida aniqlangan MNA T hujayralariga kiritilganligini ko'rsatadi. Aldegid oksidaza 1 (AOX1) ning ifodalanishi MNA ni 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) yoki 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR) ga aylantiradi; 3B-rasm) shuningdek, COL1A1 ni ifodalovchi fibroblastlar populyatsiyasi bilan cheklangan (S5A-rasm), bu birgalikda T hujayralari an'anaviy MNA metabolizmi qobiliyatiga ega emasligini ko'rsatadi. Ushbu MNA bilan bog'liq genlarning ifoda shakli HGSC bemorlarining astsitlaridan olingan ikkinchi mustaqil hujayra ma'lumotlari to'plami yordamida tekshirildi (S5B-rasm; n = 6) (16). Bundan tashqari, MNA bilan davolangan sog'lom donor T hujayralarining miqdoriy polimeraza zanjiri reaksiyasi (qPCR) tahlili shuni ko'rsatdiki, nazorat SK-OV-3 tuxumdon o'smasi hujayralari bilan solishtirganda, NNMT yoki AOX1 deyarli ifodalanmagan (3E-rasm). Bu kutilmagan natijalar MNA fibroblastlardan yoki o'smalardan TME dagi qo'shni T hujayralariga chiqarilishi mumkinligini ko'rsatadi.
Nomzodlar orasida eruvchan tashuvchi 22 (SLC22) oilasi (SLC22A1, SLC22A2 va SLC22A3) tomonidan kodlangan 1 dan 3 gacha bo'lgan organik kation tashuvchilar oilasi (OCT1, OCT2 va OCT3) bo'lsa-da, MNA ning potentsial tashuvchilari hali ham aniqlanmagan (28). Sog'lom donor T hujayralaridan olingan mRNA ning QPCR ko'rsatkichi SLC22A1 ning past ifoda darajasini, ammo SLC22A2 ning aniqlanmagan darajasini ko'rsatdi, bu esa adabiyotda ilgari xabar qilinganligini tasdiqladi (3F-rasm) (29). Aksincha, SK-OV-3 tuxumdon o'sma hujayralari liniyasi ikkala tashuvchining ham yuqori darajasini ifodaladi (3F-rasm).
T hujayralarining begona MNAni yutish qobiliyatiga ega bo'lish imkoniyatini tekshirish uchun sog'lom donor T hujayralari MNAning turli konsentratsiyalari ishtirokida 72 soat davomida kultivatsiya qilindi. Ekzogen MNA bo'lmaganda, MNAning hujayra tarkibini aniqlash mumkin emas (3G-rasm). Biroq, ekzogen MNA bilan ishlov berilgan faollashtirilgan T hujayralari hujayralardagi MNA tarkibining dozaga bog'liq ravishda 6 mM MNA gacha oshishini ko'rsatdi (3G-rasm). Bu natija shuni ko'rsatadiki, transporter ekspressiyasining past darajasi va hujayra ichidagi MNA metabolizmi uchun mas'ul bo'lgan asosiy fermentning yo'qligiga qaramay, TIL hali ham MNA ni egallashi mumkin.
Bemorlarning T hujayralaridagi metabolitlar spektri va in vitro MNA yutilish tajribalari saraton bilan bog'liq fibroblastlar (CAF) MNA ni ajratishi va o'sma hujayralari TIL fenotipi va funktsiyasini tartibga solish ehtimolini oshiradi. MNA ning T hujayralariga ta'sirini aniqlash uchun sog'lom donor T hujayralari in vitro sharoitida MNA borligida yoki yo'qligida faollashtirildi va ularning ko'payishi va sitokin ishlab chiqarilishi baholandi. Eng yuqori dozada MNA qo'shilgandan 7 kun o'tgach, populyatsiyaning ikki baravar ko'payishi o'rtacha darajada kamaydi, shu bilan birga barcha dozalarda faollik saqlanib qoldi (4A-rasm). Bundan tashqari, ekzogen MNA bilan davolash o'sma nekroz omil-α ni ifodalovchi CD4+ va CD8+ T hujayralari ulushining oshishiga olib keldi (TNFα; 4B-rasm). Aksincha, IFN-γ ning hujayra ichidagi ishlab chiqarilishi CD4+ T hujayralarida sezilarli darajada kamaydi, ammo CD8+ T hujayralarida emas va interleykin 2 da sezilarli o'zgarish kuzatilmadi (IL-2; 4-rasm, C va D). Shuning uchun, ushbu MNA bilan ishlov berilgan T hujayra kulturalaridan olingan supernatantlarning ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili (ELISA) TNFα ning sezilarli darajada oshishini, IFN-γ ning pasayishini va IL-2 ning o'zgarishini ko'rsatmadi (4-rasm, E dan G gacha). . IFN-γ ning pasayishi MNA T hujayralarining o'smalarga qarshi faolligini inhibe qilishda rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi. MNA ning T hujayralari vositachiligidagi sitotoksiklikka ta'sirini simulyatsiya qilish uchun, yashil lyuminestsent oqsil (GFP) -CAR-T) hujayralari tomonidan boshqariladigan folat retseptorlari α va CAR-T (GFP) ni nishonga oluvchi ximerik antigen retseptorlari T (FRα-CAR-T) hujayralari sog'lom donor periferik qon mononuklear hujayralari (PBMC) tomonidan ishlab chiqariladi. CAR-T hujayralari MNA ishtirokida 24 soat davomida kultivatsiya qilindi va keyin 10:1 effektor va maqsad nisbatida folat retseptorlari α ni ifodalovchi inson SK-OV-3 tuxumdon o'sma hujayralari bilan birgalikda kultivatsiya qilindi. MNA bilan davolash FRα-CAR-T hujayralarining o'ldirish faolligining sezilarli darajada pasayishiga olib keldi, bu adenozin bilan ishlov berilgan FRα-CAR-T hujayralariga o'xshash edi (4H-rasm).
(A) 7-kuni to'g'ridan-to'g'ri madaniyatdan olingan umumiy yashovchan hujayralar soni va populyatsiyaning ikki baravar ko'payishi (PD). Ustunli grafik oltita sog'lom donorning o'rtacha + SEM qiymatini ifodalaydi. Kamida n = 3 ta mustaqil tajribadan olingan ma'lumotlarni ifodalaydi. (B dan D gacha) CD3/CD28 va IL-2 T hujayralarini mos keladigan MNA konsentratsiyalarida 7 kun davomida faollashtirish uchun ishlatilgan. Tahlildan oldin hujayralar GolgiStop bilan PMA/ionomitsin bilan 4 soat davomida stimulyatsiya qilindi. T hujayralarida TNFα (B) ifodasi. Tirik hujayralarda TNFα ifodasining namunaviy tasviri (chapda) va jadval ma'lumotlari (o'ngda). T hujayralarida IFN-γ (C) va IL-2 (D) ifodasi. Sitokinlarning ifodasi oqim sitometriyasi yordamida o'lchandi. Ustunli grafik o'rtacha (n = 6 ta sog'lom donor) + SEM qiymatini ifodalaydi. P qiymatini aniqlash uchun bir tomonlama dispersiya tahlili va takroriy o'lchovlardan (*P<0.05 va **P<0.01) foydalaning. Kamida n = 3 ta mustaqil tajribadan olingan ma'lumotlarni ifodalaydi. (E dan G gacha) CD3/CD28 va IL-2 T hujayralarini mos keladigan MNA konsentratsiyalarida 7 kun davomida faollashtirish uchun ishlatilgan. Muhit PMA/ionomitsin stimulyatsiyasidan 4 soat oldin va keyin to'plangan. TNFα (E), IFN-γ (F) va IL-2 (G) konsentratsiyalari ELISA yordamida o'lchandi. Ustunli grafik o'rtacha qiymatni (n = 5 sog'lom donor) + SEM ni ifodalaydi. P qiymati bir tomonlama dispersiya tahlili va takroriy o'lchovlar yordamida aniqlanadi (*P<0.05). Nuqtali chiziq aniqlashning aniqlash chegarasini ko'rsatadi. (H) Hujayra lizisi tahlili. FRα-CAR-T yoki GFP-CAR-T hujayralari 24 soat davomida adenozin (250μM) yoki MNA (10 mM) bilan sozlangan yoki davolanmagan (Ctrl) qoldirilgan. SK-OV-3 hujayralarining o'ldirilish foizi o'lchandi. P qiymati Welch t testi bilan aniqlandi (*P<0.5 va **P<0.01).
MNAga bog'liq TNFα ekspressiyasini boshqarishni mexanik tushunish uchun MNA bilan ishlov berilgan T hujayralarining TNFα mRNKsidagi o'zgarishlar baholandi (5A-rasm). MNA bilan ishlov berilgan sog'lom donor T hujayralari TNFα transkripsiya darajasining ikki baravar oshishini ko'rsatdi, bu MNA TNFα transkripsiya regulyatsiyasiga bog'liqligini ko'rsatadi. Ushbu mumkin bo'lgan tartibga solish mexanizmini o'rganish uchun TNFα ni tartibga soluvchi ikkita ma'lum transkripsiya omillari, ya'ni faollashtirilgan T hujayra yadro omili (NFAT) va o'ziga xos oqsil 1 (Sp1), MNA ning proksimal TNFα promotoriga bog'lanishiga javoban baholandi (30). TNFα promotori bitta joyda [-55 ta asos juftligi (bp) dan] bir-birining ustiga chiqadigan 6 ta aniqlangan NFAT bog'lanish joylarini va 2 ta Sp1 bog'lanish joylarini o'z ichiga oladi (30). Xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP) shuni ko'rsatdiki, MNA bilan ishlov berilganda Sp1 ning TNFα promotoriga bog'lanishi uch baravar oshdi. NFAT ning qo'shilishi ham oshdi va ahamiyatiga yaqinlashdi (5B-rasm). Bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, MNA Sp1 transkripsiyasi orqali TNFα ifodasini va kamroq darajada NFAT ifodasini tartibga soladi.
(A) MNAsiz o'stirilgan T hujayralari bilan taqqoslaganda, MNA bilan davolangan T hujayralarida TNFα ekspressiyasining o'zgarishi. SEM bilan ifodalanish shakli ko'rsatilgan (n = 5 sog'lom donor). Kamida n = 3 ta mustaqil tajribadan olingan ma'lumotlarni ifodalaydi. (B) NFAT va Sp1 dan keyin 8 mM MNA bilan yoki unsiz davolangan T hujayralarining TNFα promotori (Ctrl) va PMA/ionomitsin stimulyatsiyasi bilan 4 soat davomida birlashtirilgan. Immunoglobulin G (IgG) va H3 mos ravishda immunoprecipitatsiya uchun salbiy va ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan. ChIP ning miqdoriy aniqlash shuni ko'rsatdiki, MNA bilan davolangan hujayralarda Sp1 va NFAT ning TNFα promotoriga bog'lanishi nazorat guruhiga nisbatan bir necha baravar oshgan. Kamida n = 3 ta mustaqil tajribadan olingan ma'lumotlarni ifodalaydi. P qiymati bir nechta t-testlar bilan aniqlangan (*** P <0.01). (C) HGSC astsitlari bilan taqqoslaganda, T hujayralari (sitotoksik bo'lmagan) o'smada TNF ekspressiyasining oshganligini ko'rsatdi. Ranglar turli bemorlarni ifodalaydi. Ko'rsatilgan hujayralar tasodifiy ravishda 300 tagacha namunalar olindi va ortiqcha tortishni cheklash uchun titradi (** Padj = 0.0076). (D) Tuxumdon saratoni uchun MNA ning taklif qilingan modeli. MNA o'sma hujayralarida va TME fibroblastlarida ishlab chiqariladi va T hujayralari tomonidan qabul qilinadi. MNA Sp1 ning TNFα promotoriga bog'lanishini oshiradi, bu esa TNFα transkripsiyasi va TNFα sitokin ishlab chiqarishning oshishiga olib keladi. MNA shuningdek, IFN-γ ning pasayishiga olib keladi. T hujayralari funktsiyasining inhibatsiyasi o'ldirish qobiliyatining pasayishiga va o'smaning tez o'sishiga olib keladi.
Xabarlarga ko'ra, TNFα old va orqa tomonga bog'liq o'smaga qarshi va o'smaga qarshi ta'sirga ega, ammo u tuxumdon saratonining o'sishi va metastazini rag'batlantirishda yaxshi ma'lum rol o'ynaydi (31-33). Xabarlarga ko'ra, tuxumdon saratoni bilan og'rigan bemorlarda assit va o'sma to'qimalarida TNFα konsentratsiyasi benign to'qimalarga qaraganda yuqori (34-36). Mexanizm nuqtai nazaridan, TNFα oq qon hujayralarining faollashishi, funktsiyasi va ko'payishini tartibga solishi va saraton hujayralarining fenotipini o'zgartirishi mumkin (37, 38). Ushbu topilmalarga muvofiq, differentsial gen ekspressiyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, TNF o'sma to'qimalaridagi T hujayralarida assitga nisbatan sezilarli darajada yuqori darajada tartibga solingan (5C-rasm). TNF ekspressiyasining oshishi faqat sitotoksik bo'lmagan fenotipga ega T hujayra populyatsiyalarida aniqlandi (S5A-rasm). Xulosa qilib aytganda, bu ma'lumotlar MNA HGSCda ikki tomonlama immunosupressiv va o'smani rag'batlantiruvchi ta'sirga ega degan fikrni qo'llab-quvvatlaydi.
Oqim sitometriyasiga asoslangan lyuminestsent yorliqlash TIL metabolizmini o'rganishning asosiy usuliga aylandi. Ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, periferik qon limfotsitlari yoki ikkilamchi limfoid organlardan olingan T hujayralari bilan solishtirganda, sichqoncha va inson TIL glyukozani qabul qilishga yuqori moyillikka ega (4, 39) va mitoxondrial funktsiyaning asta-sekin yo'qolishiga ega (19, 40). Ushbu tadqiqotda shunga o'xshash natijalarni kuzatgan bo'lsak-da, asosiy rivojlanish o'simta hujayralari metabolizmini va bir xil rezektsiya qilingan o'simta to'qimasidan olingan TILni taqqoslashdir. Ushbu oldingi hisobotlarning ba'zilariga muvofiq, assit va o'smalardan olingan o'simta (CD45-EpCAM +) hujayralari CD8 + va CD4 + T hujayralariga qaraganda yuqori glyukoza qabul qilishga ega, bu o'simta hujayralarining yuqori glyukoza qabul qilinishini T hujayralari bilan taqqoslash mumkinligini qo'llab-quvvatlaydi. T hujayralari raqobati tushunchasi. TME. Biroq, o'simta hujayralarining mitoxondrial faolligi CD8 + T hujayralariga qaraganda yuqori, ammo mitoxondrial faollik CD4 + T hujayralariga o'xshash. Ushbu natijalar oksidlovchi metabolizm o'simta hujayralari uchun muhim degan yangi mavzuni mustahkamlaydi (41, 42). Ular, shuningdek, CD8 + T hujayralari CD4 + T hujayralariga qaraganda oksidlovchi disfunktsiyaga ko'proq moyil bo'lishi mumkinligini yoki CD4 + T hujayralari mitoxondrial faollikni saqlab qolish uchun glyukozadan boshqa uglerod manbalaridan foydalanishi mumkinligini ta'kidlaydilar (43, 44). Shuni ta'kidlash kerakki, biz astsitlarda CD4 + T effektorlari, T effektor xotirasi va T markaziy xotira hujayralari o'rtasida glyukoza qabul qilish yoki mitoxondrial faollikda hech qanday farqni kuzatmadik. Xuddi shunday, o'smalardagi CD8 + T hujayralarining differentsiatsiya holati glyukoza qabul qilishdagi o'zgarishlar bilan hech qanday aloqasi yo'q, bu in vitro sharoitida o'stirilgan T hujayralari va in vivo sharoitida inson TIL o'rtasidagi sezilarli farqni ta'kidlaydi (22). Bu kuzatuvlar, shuningdek, xolis avtomatik hujayra populyatsiyasini taqsimlash orqali tasdiqlandi, bu esa o'sma hujayralariga qaraganda yuqori glyukoza qabul qilish va mitoxondrial faollikka ega CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + hujayralari keng tarqalganligini, ammo metabolik faol hujayra populyatsiyasiga ega ekanligini ko'rsatdi. Bu populyatsiya scRNA-seq tahlilida aniqlangan miyeloid supressor hujayralari yoki plazmatsitoid dendritik hujayralarning taxminiy subpopulyatsiyasini ifodalashi mumkin. Garchi bu ikkalasi ham inson tuxumdon o'smalarida qayd etilgan bo'lsa-da [45], ular hali ham ushbu miyeloid subpopulyatsiyasini tavsiflash uchun qo'shimcha ishlarni talab qiladi.
Oqim sitometriyasiga asoslangan usullar hujayra turlari orasidagi glyukoza va oksidlovchi metabolizmdagi umumiy farqlarni aniqlay olsa-da, TMEda mitoxondrial metabolizm uchun glyukoza yoki boshqa uglerod manbalari tomonidan ishlab chiqarilgan aniq metabolitlar hali aniqlanmagan. Metabolitlarning mavjudligi yoki yo'qligini ma'lum bir TIL kichik guruhiga belgilash hujayra populyatsiyasini olib tashlangan to'qimadan tozalashni talab qiladi. Shuning uchun, bizning hujayralarni boyitish usulimiz massa spektrometriyasi bilan birgalikda mos keladigan bemor namunalarida T hujayralari va o'sma hujayralari populyatsiyalarida turlicha boyitilgan metabolitlar haqida ma'lumot berishi mumkin. Ushbu usul floresan bilan faollashtirilgan hujayralarni saralashga nisbatan afzalliklarga ega bo'lsa-da, ayrim metabolit kutubxonalariga tabiiy barqarorlik va/yoki tez aylanish tezligi tufayli ta'sir ko'rsatishi mumkin (22). Shunga qaramay, bizning usulimiz ikkita tan olingan immunosupressiv metabolitlarni, adenozin va kinureninni aniqlashga muvaffaq bo'ldi, chunki ular namunalar turlari orasida juda katta farq qiladi.
O'smalar va TIL subtiplarining metabonomik tahlilimiz tuxumdon TME dagi metabolitlarning roli haqida ko'proq ma'lumot beradi. Birinchidan, oqim sitometriyasidan foydalanib, biz o'smalar va CD4 + T hujayralari o'rtasida mitoxondrial faollikda farq yo'qligini aniqladik. Biroq, LC-MS/MS tahlili ushbu populyatsiyalar orasida metabolitlar ko'pligida sezilarli o'zgarishlarni aniqladi, bu TIL metabolizmi va uning umumiy metabolik faolligi haqidagi xulosalar ehtiyotkorlik bilan talqin qilinishini talab qilishini ko'rsatadi. Ikkinchidan, MNA assitlarda CD45-hujayralar va T hujayralari o'rtasida eng katta farqga ega metabolitdir, o'smalar emas. Shuning uchun, bo'linish va o'smaning joylashuvi TIL metabolizmiga turli ta'sir ko'rsatishi mumkin, bu ma'lum bir mikro muhitda mumkin bo'lgan heterojenlikni ta'kidlaydi. Uchinchidan, MNA ishlab chiqaruvchi NNMT fermentining ifodasi asosan CAF bilan cheklangan, bu kamroq darajada o'sma hujayralari, ammo aniqlanadigan MNA darajalari o'smadan kelib chiqqan T hujayralarida kuzatiladi. Tuxumdon CAF da NNMT ning haddan tashqari ifodalanishi ma'lum saraton kasalligini kuchaytiruvchi ta'sirga ega, qisman CAF metabolizmi, o'sma invaziyasi va metastazining kuchayishi bilan bog'liq (27). TILning umumiy darajasi o'rtacha bo'lsa-da, CAFdagi NNMT ekspressiyasi Saraton Genom Atlasi (TCGA) mezenximal kichik turi bilan chambarchas bog'liq bo'lib, bu yomon prognoz bilan bog'liq (27, 46, 47). Va nihoyat, MNA degradatsiyasi uchun mas'ul bo'lgan AOX1 fermentining ekspressiyasi ham CAF populyatsiyasi bilan cheklangan, bu T hujayralarining MNA metabolizmiga qodir emasligini ko'rsatadi. Ushbu natijalar ushbu topilmani tekshirish uchun qo'shimcha ishlar talab qilinsa-da, T hujayralarida MNA ning yuqori darajasi immunosupressiv CAF mikro muhitining mavjudligini ko'rsatishi mumkin degan fikrni qo'llab-quvvatlaydi.
MNA tashuvchilarining past ifoda darajasi va MNA metabolizmida ishtirok etadigan asosiy oqsillarning aniqlanmaydigan darajalarini hisobga olgan holda, T hujayralarida MNA mavjudligi kutilmagan holat. NNMT ham, AOX1 ham scRNA-seq tahlili va ikkita mustaqil kohortaning maqsadli qPCR orqali aniqlana olmadi. Bu natijalar MNA T hujayralari tomonidan sintez qilinmasligini, balki atrofdagi TME dan so'rilishini ko'rsatadi. In vitro tajribalar shuni ko'rsatadiki, T hujayralari ekzogen MNA to'plashga moyil.
Bizning in vitro tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, ekzogen MNA T hujayralarida TNFα ifodasini keltirib chiqaradi va Sp1 ning TNFα promotoriga bog'lanishini kuchaytiradi. TNFα ham o'smaga qarshi, ham o'smaga qarshi funktsiyalarga ega bo'lsa-da, tuxumdon saratonida TNFα tuxumdon saratonining o'sishini rag'batlantirishi mumkin (31-33). Tuxumdon o'sma hujayralari kulturasida TNFα ni neytrallashtirish yoki sichqoncha modellarida TNFα signalini yo'q qilish TNFα vositachiligidagi yallig'lanish sitokinlarini ishlab chiqarishni yaxshilashi va o'sma o'sishini inhibe qilishi mumkin (32, 35). Shuning uchun, bu holda, TME dan olingan MNA avtokrin halqa orqali TNFα ga bog'liq mexanizm orqali yallig'lanishni qo'zg'atuvchi metabolit sifatida harakat qilishi mumkin, shu bilan tuxumdon saratonining paydo bo'lishi va tarqalishini rag'batlantiradi (31). Ushbu imkoniyatga asoslanib, TNFα blokadasi tuxumdon saratoni uchun potentsial terapevtik vosita sifatida o'rganilmoqda (37, 48, 49). Bundan tashqari, MNA CAR-T hujayralarining tuxumdon o'sma hujayralariga sitotoksikligini pasaytiradi, bu MNA vositachiligidagi immunitetni bostirish uchun qo'shimcha dalillarni taqdim etadi. Umuman olganda, bu natijalar o'smalar va CAF hujayralari MNA ni hujayradan tashqari TME ga ajratadigan modelni ko'rsatadi. (i) TNF tomonidan qo'zg'atilgan tuxumdon saratoni o'sishini rag'batlantirish va (ii) MNA tomonidan qo'zg'atilgan T hujayralarining sitotoksik faolligini inhibe qilish orqali bu ikki tomonlama o'sma ta'siriga ega bo'lishi mumkin (5D-rasm).
Xulosa qilib aytganda, tezkor hujayralarni boyitish, bitta hujayrali ketma-ketlik va metabolik profillash kombinatsiyasini qo'llash orqali ushbu tadqiqot HGSC bemorlarida o'smalar va assit hujayralari o'rtasida katta immunometabolomik farqlarni aniqladi. Ushbu keng qamrovli tahlil T hujayralari o'rtasida glyukoza qabul qilish va mitoxondrial faollikda farqlar borligini ko'rsatdi va MNA ni hujayra bo'lmagan avtonom immun regulyator metabolit sifatida aniqladi. Ushbu ma'lumotlar TME ning inson saratonida T hujayralari metabolizmiga qanday ta'sir qilishiga ta'sir qiladi. T hujayralari va saraton hujayralari o'rtasida ozuqa moddalari uchun to'g'ridan-to'g'ri raqobat haqida xabar berilgan bo'lsa-da, metabolitlar o'smaning rivojlanishini rag'batlantirish va ehtimol endogen immun javoblarni bostirish uchun bilvosita regulyator sifatida ham harakat qilishi mumkin. Ushbu regulyator metabolitlarning funktsional rolini batafsil tavsiflash o'smalarga qarshi immunitet javobini kuchaytirish uchun muqobil strategiyalarni ochishi mumkin.
Bemor namunalari va klinik ma'lumotlar Kanada to'qima ombori tarmog'i tomonidan sertifikatlangan BC saraton o'sma to'qima ombori orqali olindi. BC Saraton tadqiqotlari etikasi qo'mitasi va Britaniya Kolumbiyasi universiteti (H07-00463) tomonidan tasdiqlangan protokolga muvofiq, barcha bemorlarning namunalari va klinik ma'lumotlari yozma ravishda xabardor qilingan yoki o'z roziligidan rasman voz kechilgan. Namunalar sertifikatlangan BioBankda (BRC-00290) saqlanadi. Bemorning batafsil xususiyatlari S1 va S5 jadvallarida keltirilgan. Kriokonservatsiya uchun bemorning o'sma namunasini mexanik ravishda parchalash va keyin uni 100 mikronli filtrdan o'tkazib, bitta hujayrali suspenziya olish uchun skalpel ishlatiladi. Bemorning astsitlari hujayralarni maydalash va supernatantni olib tashlash uchun 4°C da 1500 rpm tezlikda 10 daqiqa davomida santrifuga qilindi. O'sma va assitdan olingan hujayralar 50% issiqlik bilan inaktivatsiyalangan inson AB zardobida (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) va 10% dimetil sulfoksidda kriokonservatsiya qilindi. Ushbu konservatsiyalangan bitta hujayrali suspenziyalar eritildi va quyida tavsiflangan metabolomika va metabolitlarni aniqlash uchun ishlatildi.
To'liq muhit 0,22 μm filtrlangan 50:50 qo'shimchali RPMI 1640: AimV dan iborat. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) 10% issiqlik bilan inaktivatsiyalangan inson AB zardobi (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penitsillin Streptomitsin (PenStrep) eritmasi (Thermo Fisher Scientific) va 50 μMB-merkaptoetanol bilan to'ldirilgan. AimV (Invitrogen) 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) va 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) bilan to'ldirilgan. Oqim sitometrini bo'yash buferi 3% issiqlik bilan inaktivatsiyalangan AB inson zardobi (Sigma) bilan to'ldirilgan 0,22 μm filtrlangan fosfat buferlangan sho'r suvdan (PBS; Invitrogen) iborat edi. Hujayra boyitish buferi 0,22 μm filtrlangan PBS dan iborat va 0,5% issiqlik bilan inaktivatsiyalangan inson AB zardobi (Sigma-Aldrich) bilan to'ldirilgan.
37°C to'liq muhitda hujayralar 10 nM MT DR va 100 μM 2-NBDG bilan 30 daqiqa davomida bo'yaldi. Keyin, hujayralar 4°C da 15 daqiqa davomida eF506 yashovchanlik bo'yog'i bilan bo'yaldi. Hujayralarni FC Block (eBioscience) va Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) da qayta eritib oling, oqim sitometri bo'yash buferida suyultiring (ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq) va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Hujayralarni 4°C da 20 daqiqa davomida oqim sitometri bo'yash buferida antitelolar to'plami (S2-jadval) bilan bo'yang. Tahlil qilishdan oldin hujayralarni oqim sitometri bo'yash buferida (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguratsiyasi) qayta eritib oling. Hujayralar soni ma'lumotlarini tahlil qilish uchun SpectroFlo va FlowJo V10 dan foydalaning va ma'lumotlarni yaratish uchun GraphPad Prism 8 dan foydalaning. 2-NBDG va MT DR ning o'rtacha lyuminestsentsiya intensivligi (MFI) log-normallashtirildi va keyin mos keladigan bemorlarni hisobga olish uchun statistik tahlil uchun juftlashgan t-test qo'llanildi. Tahlildan 40 tadan kam hodisaga ega barcha populyatsiyalarni olib tashlang; statistik tahlil va ma'lumotlarni vizualizatsiya qilishdan oldin har qanday salbiy qiymatlar uchun 1 MFI qiymatini kiriting.
Yuqoridagi jarayon panelining qo'lda darvozalash strategiyasini to'ldirish uchun biz FlowJo-dagi o'lik hujayralarni yo'q qilgandan so'ng, hujayralarni populyatsiyaga avtomatik ravishda tayinlash uchun shaklni cheklash daraxti (FAUST) (21) tomonidan to'liq izohdan foydalandik. Biz noto'g'ri joylashtirilganga o'xshagan (PD1+ ni PD1-o'sma hujayralari bilan birlashtirish) va saqlanib qolgan populyatsiyalarni birlashtirish uchun chiqishni qo'lda boshqaramiz. Har bir namunada o'rtacha 2% dan ortiq hujayralar mavjud bo'lib, jami 11 ta populyatsiya mavjud.
PBMC ni leykotsitlarni ajratish mahsulotlaridan (STEMCELL Technologies) ajratish uchun Ficoll gradient zichlik santrifugatsiyasi qo'llanildi. CD8 + T hujayralari PBMC dan CD8 MicroBeads (Miltenyi) yordamida ajratildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq 2 hafta davomida TransAct (Miltenyi) yordamida to'liq muhitda kengaytirildi. Hujayralar IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) o'z ichiga olgan to'liq muhitda 5 kun turishga ruxsat berildi va keyin TransAct bilan qayta stimulyatsiya qilindi. 7-kuni, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, hujayralarni ketma-ket uchta turda boyitish uchun inson CD45 MicroBeads (Miltenyi) ishlatildi. Hujayralar oqim sitometriyasi tahlili uchun (yuqorida tavsiflanganidek) ajratildi va bir million hujayra LC-MS/MS tahlili uchun uch marta ajratildi. Namunalar quyida tavsiflanganidek LC-MS/MS tomonidan qayta ishlandi. Biz yo'qolgan metabolit qiymatini 1000 ion raqami bilan baholadik. Har bir namuna umumiy ion soni (TIC) bilan normallashtiriladi, logarifmik ravishda o'zgartiriladi va tahlildan oldin MetaboAnalystR da avtomatik ravishda normallashtiriladi.
Har bir bemorning bitta hujayrali suspenziyasi eritilib, 40 mkm filtr orqali to'liq muhitga filtrlandi (yuqorida tavsiflanganidek). Ishlab chiqaruvchining protokoliga ko'ra, CD8+, CD4+ va CD45-hujayralari uchun namunalarni boyitish uchun (muzda) MicroBeads (Miltenyi) yordamida magnit munchoqlarni ajratish orqali ketma-ket uchta musbat tanlov bosqichi qo'llanildi. Qisqasi, hujayralar hujayralarni boyitish buferida qayta suspenziyalanadi (yuqorida tavsiflanganidek) va sanaladi. Hujayralar inson CD8 munchoqlari, inson CD4 munchoqlari yoki inson CD45 munchoqlari (Miltenyi) bilan 4°C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin hujayralarni boyitish buferi bilan yuvildi. Namuna LS ustunidan (Miltenyi) o'tkaziladi va musbat va manfiy fraksiyalar yig'iladi. Davomiylikni kamaytirish va hujayralarni tiklash bosqichini maksimal darajada oshirish uchun CD8 fraksiya CD4+ boyitishning ikkinchi bosqichi uchun ishlatiladi va CD4 fraksiya keyingi CD45 boyitish uchun ishlatiladi. Ajratish jarayoni davomida eritmani muzda saqlang.
Metabolitlarni tahlil qilish uchun namunalarni tayyorlash uchun hujayralar muzdek tuz eritmasi bilan bir marta yuvildi va har bir namunaga 1 ml 80% metanol qo'shildi, so'ngra vortekslandi va suyuq azotda muzlatildi. Namunalar uchta muzlatish-eritish sikliga duchor qilindi va 4°C da 15 daqiqa davomida 14000 rpm tezlikda santrifuga qilindi. Metabolitlarni o'z ichiga olgan supernatant quriguncha bug'lanadi. Metabolitlar 50 mkl 0,03% chumoli kislotasida qayta eritildi, aralashtirish uchun vortekslandi va keyin qoldiqlarni olib tashlash uchun santrifuga qilindi.
Yuqorida tavsiflanganidek, metabolitlarni ajratib oling. Metabolomika tadqiqotlari uchun supernatantni yuqori samarali suyuq xromatografiya shishasiga o'tkazing. Partiya ta'sirini oldini olish uchun har bir namunani bir xil miqdordagi hujayralar bilan ishlov berish uchun tasodifiy ishlov berish protokolidan foydalaning. Biz ilgari AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) da nashr etilgan global metabolitlarning sifat jihatidan bahosini o'tkazdik. Xromatografik tahlil va cho'qqilar maydoni integratsiyasi MultiQuant 2.1 versiyasi dasturi (Applied Biosystems SCIEX) yordamida amalga oshirildi.
Yo'qolgan metabolit qiymatini baholash uchun 1000 ga teng ion soni ishlatilgan va har bir namunaning TICsi namunani qayta ishlash natijasida instrumental tahlil orqali kiritilgan o'zgarishlarni tuzatish uchun har bir aniqlangan metabolitning normallashtirilgan cho'qqi maydonini hisoblash uchun ishlatilgan. TIC normallashtirilgandan so'ng, logarifmik konvertatsiya va avtomatik norma chizig'ini masshtablash uchun MetaboAnalystR(51) (standart parametr) ishlatiladi. Biz namuna turlari orasidagi metabolom farqlarini kashfiyot tahlilini o'tkazish uchun vegan R paketi bilan PCA dan foydalandik va bemorlarni tahlil qilish uchun qisman ortiqcha tahlildan foydalandik. Namunalar orasidagi Evklid masofasini klasterlash uchun issiqlik xaritasi dendrogrammasini tuzish uchun Ward usulidan foydalaning. Biz butun hujayra turi va mikro muhit bo'ylab turlicha ko'p metabolitlarni aniqlash uchun standartlashtirilgan metabolitlar ko'pligi bo'yicha limma (52) dan foydalandik. Tushuntirishni soddalashtirish uchun biz modelni belgilash uchun guruh o'rtacha parametridan foydalanamiz va mikro muhitdagi hujayra turlarini har bir guruh sifatida ko'rib chiqamiz (n = 6 guruh); Ahamiyatlilik testi uchun biz har bir metabolit uchun uchta takroriy o'lchov o'tkazdik. Soxta replikatsiyaning oldini olish uchun bemor limma dizayniga to'siq sifatida kiritildi. Turli bemorlar o'rtasidagi metabolitlardagi farqlarni tekshirish uchun biz bemorlarni o'z ichiga olgan limma modelini belgilangan tarzda sozladik. Biz hujayra turi va Padj <0.05 mikro muhiti o'rtasidagi oldindan belgilangan kontrastning ahamiyatini xabar qilamiz (Benjamini-Xochberg tuzatishi).
Miltenyi o'lik hujayralarni olib tashlash to'plami (>80% hayotiylik) yordamida kuch bilan boyitilgandan so'ng, 10x 5'gen ifoda protokoli yordamida umumiy tirik muzlatilgan assit va o'sma namunalarida bitta hujayrali transkriptom ketma-ketligi amalga oshirildi. Mos keladigan o'smalar va assitlar bilan beshta holat tahlil qilindi, ammo bitta o'sma namunasidan olingan past hayotiylik uning kiritilishiga to'sqinlik qildi. Bemorlarning bir nechta tanloviga erishish uchun biz har bir bemorning namunalarini 10x xrom kontrollerining qatorlarida birlashtirdik va assit va o'sma joylarini alohida tahlil qildik. Ketma-ketlikdan so'ng [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp juftlashgan uchi (PE), Kvebek genom; O'simta va assit uchun har bir hujayra uchun o'rtacha 73 488 va 41 378 ta o'qish]], biz CellSNP va Vireo (53) dan foydalandik (CellSNP asosida GRCh38 tomonidan taqdim etilgan oddiy inson SNP (VCF) donor identifikatsiyasiga ega. Biz bemorning genotip holatining (IBS) eng yaqin identifikatsiyasini (IBS) aniqlash uchun SNPRelate dan foydalanamiz, tayinlanmagan hujayralar va dupleks sifatida aniqlangan hujayralar va assit va o'simta namunalari orasidagi mos keladigan donorlarni chiqarib tashlaymiz (54). Ushbu vazifa asosida biz o'simta va assitda hujayralar ko'p miqdorda namoyish etilgan uchta holatni tahlil qilish uchun saqlab qoldik. Scater (55) va scran (56) BioConductor o'ramida massa filtrlash bosqichini bajargandan so'ng, tahlil qilish uchun 6975 hujayra (mos ravishda o'simta va assitdan 2792 va 4183 hujayra) hosil bo'ldi. Biz Jaccard masofasiga asoslangan umumiy eng yaqin qo'shni tarmog'ining (SNN) igraph (57) Louvain klasterlashidan foydalanamiz. Klaster hujayralari ifodasi bo'yicha. Klasterlar marker genining ifodasiga asoslangan taxminiy hujayra turlariga qo'lda izoh berildi va t-SNE bilan vizualizatsiya qilindi. Sitotoksik T hujayralari CD8A va GZMA ifodasi bilan aniqlanadi, ribosomal oqsil ifodasi past bo'lgan subklasterlar bundan mustasno. Biz Izar va boshqalarning (16) nashr etilgan ma'lumotlariga, jumladan, ularning t-SNE joylashtirilishiga murojaat qildik, bu immun hujayra markerlari va NNMT ifodasi o'rtasidagi ifoda o'xshashligini boshqarishi mumkin.
PBMC leykotsitlarni ajratish mahsulotlaridan (STEMCELL Technologies) Ficoll gradient zichlik santrifugasi yordamida ajratildi. CD3 + hujayralari PBMC dan CD3 boncuklari (Miltenyi) yordamida ajratildi. MNA mavjudligida yoki yo'qligida, CD3 + hujayralari plastinkaga bog'langan CD3 (5 mkg/ml), eruvchan CD28 (3 mkg/ml) va IL-2 (300 U/ml; Proleukin) bilan faollashtirildi. Kengayishning oxirgi kunida hayotiylik (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) va proliferatsiya (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) oqim sitometriyasi yordamida baholandi. GolgiStop yordamida 4 soat davomida PMA (20 ng/ml) va ionomitsin (1 mkg/ml) bilan hujayralarni stimulyatsiya qilish orqali effektor funktsiyasini baholang va CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) va TNFα-fluoressein izotiyosiyanat (FITC) (MAb11, BD) ni kuzating. 4 soat davomida qPCR va ChIP hujayralarini PMA (20 ng/ml) va ionomitsin (1 mkg/ml) bilan stimulyatsiya qiling. ELISA supernatanti 4 soat davomida PMA (20 ng/ml) va ionomitsin (1 mkg/ml) bilan stimulyatsiyadan oldin va keyin to'plandi.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) yordamida RNKni ajratib olish uchun ishlab chiqaruvchining protokoliga amal qiling. Namunani gomogenizatsiya qilish uchun QIAshredder (QIAGEN) dan foydalaning. Komplementar DNK (cDNA) sintez qilish uchun yuqori sig'imli RNKdan kDNKga to'plamdan (Thermo Fisher Scientific) foydalaning. Quyidagi zondlar yordamida gen ekspressiyasini (ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq) aniqlash uchun TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) dan foydalaning: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldegid-3-fosfat off vodorod (GAPDH)] va Hs01010726_m1 (SLC22A2). Namunalar MicroAmp optik plyonkali MicroAmp tezkor optik 96 quduqli reaksiya plastinkasida (Applied Biosystems) StepOnePlus real vaqt rejimidagi PCR tizimida (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ishga tushirildi. 35 dan oshadigan har qanday Ct qiymati aniqlash chegarasidan yuqori deb hisoblanadi va aniqlanmaydi deb belgilanadi.
Avval tasvirlanganidek (58) ChIP ni bajaring. Qisqasi, hujayralar formaldegid bilan ishlov berildi (yakuniy konsentratsiya 1,42%) va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Qo'shimcha shish buferidan (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl va 0,1% NP-40) muz ustida 10 daqiqa davomida foydalaning, so'ngra tasvirlanganidek (58) immunoprecipitatsiya buferida qayta suspenziya qiling. Keyin namuna quyidagi sikllar bilan sonikatsiya qilindi: 10 sikl (20 ta 1 soniyali impulslar) va 40 soniyali statik vaqt. ChIP darajasidagi immunoglobulin G (hujayra signalizatsiya texnologiyasi; 1 mkl), giston H3 (hujayra signalizatsiya texnologiyasi; 3 mkl), NFAT (Invitrogen; 3 mkl) va SP1 (hujayra signalizatsiya texnologiyasi; 3 mkl) antikorlarini namunani 4°CC haroratda bir kechada chayqatib inkubatsiya qiling. A oqsili boncuklarini (Thermo Fisher Scientific) namuna bilan 4°C haroratda 1 soat davomida yengil chayqatib inkubatsiya qiling, so'ngra DNKni boyitish uchun chelex boncuklaridan (Bio-Rad) foydalaning va oqsilni hazm qilish uchun proteinaza K (Thermo Fisher) dan foydalaning. TNFα promotori PZR orqali aniqlandi: oldinga, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; aksincha, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp mahsulot). Tasvirlar Image Lab (Bio-Rad) tomonidan ishlab chiqarilgan va ImageJ dasturi yordamida miqdoriy jihatdan aniqlangan.
Hujayra kulturasi supernatanti yuqorida tavsiflanganidek yig'ildi. Aniqlash ishlab chiqaruvchining inson TNFα ELISA to'plami (Invitrogen), inson IL-2 ELISA to'plami (Invitrogen) va inson IFN-γ ELISA to'plami (Abcam) protseduralariga muvofiq amalga oshirildi. Ishlab chiqaruvchining protokoliga ko'ra, supernatant TNFα va IL-2 ni aniqlash uchun 1:100 va IFN-γ ni aniqlash uchun 1:3 nisbatda suyultirildi. 450 nm da absorbansni o'lchash uchun EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) dan foydalaning.
PBMC leykotsitlarni ajratish mahsulotlaridan (STEMCELL Technologies) Ficoll gradient zichlik santrifugasi yordamida ajratildi. CD3 + hujayralari PBMC dan CD3 boncuklari (Miltenyi) yordamida ajratildi. MNA mavjudligida yoki yo'qligida, CD3 + hujayralari plastinkaga bog'langan CD3 (5 mkg/ml), eruvchan CD28 (3 mkg/ml) va IL-2 (300 U/ml; Proleukin) bilan 3 kun davomida faollashtirildi. 3 kundan so'ng, hujayralar yig'ilib, 0,9% fiziologik eritma bilan yuvildi va granula muzlatildi. Hujayralar soni 123count eBeads yordamida oqim sitometriyasi (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguratsiyasi) yordamida amalga oshirildi.
Yuqorida tavsiflanganidek, metabolitlarni ekstraktsiya qiling. Quritilgan ekstrakt 4000 hujayra ekvivalenti/mkl konsentratsiyasida qayta tiklandi. Namunani teskari fazali xromatografiya (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) va CORTECS T3 ustuni (2.1×150 mm, zarracha hajmi 1.6-mkm, g'ovak hajmi 120-Å; #186008500, Waters) yordamida tahlil qiling. Elektrosprey ionizatsiyasi musbat rejimda ishlaydigan qutbli massa spektrometri (6470, Agilent). Mobil A fazasi 0.1% chumoli kislotasidan (H2O da), mobil B fazasi 90% asetonitrildan, 0.1% chumoli kislotasidan iborat. LC gradiyenti 100% A uchun 0 dan 2 minutgacha, 99% B uchun 2 dan 7,1 minutgacha va 99% B uchun 7,1 dan 8 minutgacha. Keyin ustunni 3 daqiqa davomida 0,6 ml/min oqim tezligida harakatlanuvchi A fazasi bilan qayta muvozanatlashtiring. Oqim tezligi 0,4 ml/min ni tashkil qiladi va ustun kamerasi 50°C gacha qizdiriladi. Saqlash vaqti (RT) va transformatsiyani (RT = 0,882 daqiqa, 1-transformatsiya = 137→94,1, 2-transformatsiya = 137→92, 3-konversiya = 137→78) aniqlash uchun MNA ning sof kimyoviy standartidan (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) foydalaning. Uchala o'tish ham to'g'ri saqlash vaqtida sodir bo'lganda, o'ziga xoslikni ta'minlash uchun 1-o'tish usuli qo'llaniladi. MNA (Toronto Research Chemical Company) ning standart egri chizig'i mos ravishda 0,1, 1,0, 10 va 100 ng/ml va 1,0 va 10 mkg/ml suyuqlik standartlarini olish uchun standart eritmaning (1 mg/ml) oltita ketma-ket suyultirilishi orqali hosil qilindi. Aniqlash chegarasi 1 ng/ml ni tashkil qiladi va chiziqli javob 10 ng/ml va 10 mkg/ml oralig'ida. LC/MS tahlili uchun ikki mikrolitr namuna va standartning har bir in'ektsiyasi qo'llaniladi va tahlil platformasining barqarorligini ta'minlash uchun har sakkizta in'ektsiyada aralash sifat nazorati namunasi amalga oshiriladi. MNA bilan ishlov berilgan barcha hujayra namunalarining MNA javoblari tahlilning chiziqli diapazonida edi. Ma'lumotlar tahlili MassHunter miqdoriy tahlil dasturi (v9.0, Agilent) yordamida amalga oshirildi.
Ikkinchi avlod αFR-CAR konstruktsiyasi Song va boshqalardan olingan (59). Qisqasi, konstruktsiya quyidagi tarkibni o'z ichiga oladi: CD8a yetakchi ketma-ketligi, inson αFR-ga xos bitta zanjirli o'zgaruvchan fragment, CD8a menteşe va transmembran mintaqasi, CD27 hujayra ichidagi domen va CD3z hujayra ichidagi domen. To'liq CAR ketma-ketligi GenScript tomonidan sintez qilindi va keyin transduktsiya samaradorligini baholash uchun ishlatiladigan GFP ekspressiya kassetasining yuqori oqimidagi ikkinchi avlod lentivirus ekspressiya vektoriga klonlandi.
Lentivirus HEK293T hujayralarini transfeksiya qilish yo'li bilan ishlab chiqariladi [Amerika tipidagi madaniyat to'plami (ATCC); Dulbecco'ning 10% homila sigir zardobi (FBS) va 1% PenStrep o'z ichiga olgan modifikatsiyalangan Eagle muhitida o'stiriladi va CAR-GFP vektori va ishlatiladi. Qadoqlash plazmidlari (psPAX2 va pMD2.G, Addgene) lipofeksiya ominidan (Sigma-Aldrich) foydalanadi. Virus o'z ichiga olgan supernatant transfeksiyadan 48 va 72 soat o'tgach to'planadi, filtrlanadi va ultratsentrifugatsiya orqali konsentratsiyalanadi. Konsentrlangan virusli supernatant transduksiya qilinmaguncha -80°C da saqlanadi.
PBMClar sog'lom donor leykotsitlarni ajratish mahsulotlaridan (STEMCELL Technologies) Ficoll gradient zichlik santrifugasi yordamida ajratiladi. CD8+ hujayralarini PBMCdan ajratish uchun musbat selektsiya CD8 mikroboncuklaridan (Miltenyi) foydalaning. T hujayralarini TransAct (Miltenyi) va TexMACS muhitida stimulyatsiya qiling [Miltenyi; 3% issiqlik bilan inaktivatsiyalangan inson zardobi, 1% PenStrep va IL-2 (300 U/ml) bilan to'ldirilgan]. Rag'batlantirishdan yigirma to'rt soat o'tgach, T hujayralari lentivirus (106 hujayraga 10 mkl konsentrlangan virus supernatanti) bilan transduksiya qilindi. Cytek Aurorada transduksiyadan 1-3 kun o'tgach (FSC (Oldinga sochish)/SSC (Yon sochish), Singlet, GFP+ da), hujayralarning GFP ifodasini baholang, transduksiya samaradorligini kamida 30% ni namoyish eting.
CAR-T hujayralari Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep bilan to'ldirilgan) da 24 soat davomida quyidagi sharoitlarda kultivatsiya qilindi: ishlov berilmagan, 250 μM adenozin yoki 10 mM MNA bilan ishlov berilgan. Dastlabki ishlov berilgandan so'ng, CAR-T hujayralari PBS bilan yuvildi va 10 da 10% FBS va 1% PenStrep bilan to'ldirilgan 20 000 SK-OV-3 hujayralari [ATCC; McCoy 5A muhitida (Sigma-Aldrich): 1 ning effektorning nishonga nisbati qo'shimcha Immunocult muhitida uch nusxada kuchaytirildi. Digitalis saponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) bilan lizislangan SK-OV-3 hujayralari va mos ravishda musbat nazorat guruhi sifatida ishlatilgan. 24 soatlik birgalikda yetishtirilgandan so'ng, supernatant yig'ildi va laktat dehidrogenaza (LDH) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) muvofiq o'lchandi. LDH supernatanti LDH buferida 1:50 nisbatda suyultirildi. O'ldirish foizi quyidagi formula yordamida o'lchandi: o'ldirish foizi = tuzatish foizi / maksimal o'ldirish darajasi x 100%, bu yerda tuzatish foizi = faqat birgalikda yetishtirilgan T hujayralari va maksimal o'ldirish darajasi = musbat nazorat-manfiy nazorat.
Matnda yoki materiallar va usullarda tasvirlanganidek, statistik tahlil uchun GraphPad Prism 8, Microsoft Excel yoki R v3.6.0 dan foydalaning. Agar bir xil bemordan bir nechta namunalar to'plansa (masalan, assit va o'sma), biz juftlashgan t-testdan foydalanamiz yoki bemorni tasodifiy effekt sifatida chiziqli yoki umumlashtirilgan modelga kiritamiz. Metabolomika tahlili uchun ahamiyatlilik testi uch nusxada amalga oshiriladi.
Ushbu maqola uchun qo'shimcha materiallar uchun http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ga qarang.
Bu Creative Commons Attribution-Notijorat Litsenziyasi shartlari asosida tarqatiladigan ochiq kirish maqolasi bo'lib, u har qanday vositada foydalanish, tarqatish va ko'paytirishga imkon beradi, agar oxirgi foydalanish tijorat maqsadlarida foydalanilmasa va asl asar to'g'ri bo'lsa.
Eslatma: Sizdan faqat elektron pochta manzilingizni taqdim etishingizni so'raymiz, shunda sahifaga tavsiya qilgan odam siz elektron pochtani ko'rishini xohlayotganingizni va u spam emasligini biladi. Biz hech qanday elektron pochta manzillarini yozib olmaymiz.
Bu savol sizning tashrif buyuruvchi ekanligingizni tekshirish va avtomatik spam yuborishning oldini olish uchun ishlatiladi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sara Makferson (Sarah Makferson), Loren G. Zakariya (Loren G. Zakariya), Abigayl Eli Aris G. Uotson (H. Uotson), Jon Stagg (Jon Stagg), Bred X. Nelson (Bred X. J. Nelson), Rallar DeBerardinis), Rassell G. Jons (Russel G. Jons), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA T hujayralarining immunitetini bostirishga hissa qo'shadi va inson saratonini davolash uchun potentsial immunoterapiya maqsadini ifodalaydi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sara Makferson (Sarah Makferson), Loren G. Zakariya (Loren G. Zakariya), Abigayl Eli Aris G. Uotson (H. Uotson), Jon Stagg (Jon Stagg), Bred X. Nelson (Bred X. J. Nelson), Rallar DeBerardinis), Rassell G. Jons (Russel G. Jons), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA T hujayralarining immunitetini bostirishga hissa qo'shadi va inson saratonini davolash uchun potentsial immunoterapiya maqsadini ifodalaydi.
©2021 Amerika fan taraqqiyoti assotsiatsiyasi. barcha huquqlar himoyalangan. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef va COUNTER hamkori hisoblanadi. Science Advances ISSN 2375-2548.