Propion kislotasi (PPA), antifungal vosita va keng tarqalgan parhez qo'shimchasi, sichqonlarda oshqozon-ichak disfunktsiyasi bilan birga keladigan g'ayritabiiy neyro rivojlanishiga olib kelishi ko'rsatilgan, bu esa ichak disbiozi tufayli yuzaga kelishi mumkin. PPA ning parhezga ta'siri va ichak mikrobiotasining disbiozi o'rtasidagi bog'liqlik taklif qilingan, ammo to'g'ridan-to'g'ri o'rganilmagan. Bu yerda biz disbiozga olib kelishi mumkin bo'lgan ichak mikrobiota tarkibidagi PPA bilan bog'liq o'zgarishlarni o'rgandik. Davolanmagan parhez (n=9) va PPA bilan boyitilgan parhez (n=13) bilan oziqlangan sichqonlarning ichak mikrobiomlari mikrobial tarkib va ​​bakterial metabolik yo'llardagi farqlarni baholash uchun uzoq masofali metagenomik ketma-ketlik yordamida ketma-ketlashtirildi. Parhez PPA bir nechta Bacteroides, Prevotella va Ruminococcus turlarini o'z ichiga olgan muhim taksonlarning ko'pligining ortishi bilan bog'liq edi, ularning a'zolari ilgari PPA ishlab chiqarishda ishtirok etgan. PPA ta'sirida bo'lgan sichqonlarning mikrobiomlarida lipid metabolizmi va steroid gormonlar biosintezi bilan bog'liq ko'proq yo'llar ham mavjud edi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, PPA ichak mikrobiotasini va unga bog'liq metabolik yo'llarni o'zgartirishi mumkin. Kuzatilgan bu o'zgarishlar iste'mol qilish uchun xavfsiz deb tasniflangan konservantlar ichak mikrobiotasining tarkibiga va o'z navbatida inson salomatligiga ta'sir qilishi mumkinligini ta'kidlaydi.
Inson mikrobiomi ko'pincha "tananing oxirgi organi" deb ataladi va inson salomatligida muhim rol o'ynaydi (Baquero va Nombela, 2012). Xususan, ichak mikrobiomi tizimli ta'siri va ko'plab muhim funktsiyalardagi roli bilan tanilgan. Ichakda komensal bakteriyalar ko'p bo'lib, bir nechta ekologik joylarni egallaydi, ozuqa moddalaridan foydalanadi va potentsial patogenlar bilan raqobatlashadi (Jandhyala va boshqalar, 2015). Ichak mikrobiotasining turli xil bakterial komponentlari vitaminlar kabi muhim ozuqa moddalarini ishlab chiqarish va ovqat hazm qilishni rag'batlantirishga qodir (Rowland va boshqalar, 2018). Bakterial metabolitlar ham to'qimalarning rivojlanishiga ta'sir qilishi va metabolik va immun yo'llarini kuchaytirishi ko'rsatilgan (Heijtz va boshqalar, 2011; Yu va boshqalar, 2022). Inson ichak mikrobiomining tarkibi juda xilma-xil bo'lib, ovqatlanish, jins, dori-darmonlar va sog'liq holati kabi genetik va atrof-muhit omillariga bog'liq (Kumbhare va boshqalar, 2019).
Onaning ovqatlanishi homila va yangi tug'ilgan chaqaloq rivojlanishining muhim tarkibiy qismi va rivojlanishga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan birikmalarning taxminiy manbai hisoblanadi (Bazer va boshqalar, 2004; Innis, 2014). Bunday qiziqish uyg'otadigan birikmalardan biri propion kislotasi (PPA) bo'lib, u bakterial fermentatsiyadan olingan qisqa zanjirli yog 'kislotasi qo'shimcha mahsuloti va oziq-ovqat qo'shimchasi hisoblanadi (den Besten va boshqalar, 2013). PPA antibakterial va antifungal xususiyatlarga ega va shuning uchun oziq-ovqat konservanti sifatida va sanoat qo'llanmalarida mog'or va bakteriyalar o'sishini inhibe qilish uchun ishlatiladi (Wemmenhove va boshqalar, 2016). PPA turli to'qimalarda turli xil ta'sirga ega. Jigarda PPA makrofaglarda sitokin ekspressiyasiga ta'sir qilish orqali yallig'lanishga qarshi ta'sirga ega (Kawasoe va boshqalar, 2022). Ushbu tartibga soluvchi ta'sir boshqa immun hujayralarida ham kuzatilgan, bu yallig'lanishning pasayishiga olib keladi (Haase va boshqalar, 2021). Biroq, miyada teskari ta'sir kuzatilgan. Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, PPA ta'siri sichqonlarda autizmga o'xshash xatti-harakatlarni keltirib chiqaradi (El-Ansary va boshqalar, 2012). Boshqa tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, PPA gliozni keltirib chiqarishi va miyada yallig'lanishni qo'zg'atish yo'llarini faollashtirishi mumkin (Abdelli va boshqalar, 2019). PPA kuchsiz kislota bo'lgani uchun u ichak epiteliyasi orqali qon oqimiga tarqalib, shu bilan qon-miya to'sig'i, shuningdek, yo'ldosh kabi cheklovchi to'siqlarni kesib o'tishi mumkin (Stinson va boshqalar, 2019), bu esa PPA ning bakteriyalar tomonidan ishlab chiqariladigan tartibga soluvchi metabolit sifatidagi ahamiyatini ta'kidlaydi. PPA ning autizm uchun xavf omili sifatidagi potentsial roli hozirda o'rganilayotgan bo'lsa-da, uning autizmga chalingan odamlarga ta'siri asab differentsiatsiyasini qo'zg'atishdan tashqariga chiqishi mumkin.
Neyrologik rivojlanish buzilishlari bo'lgan bemorlarda diareya va ich qotishi kabi oshqozon-ichak alomatlari keng tarqalgan (Cao va boshqalar, 2021). Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, autizm spektri buzilishlari (ASD) bo'lgan bemorlarning mikrobiomi sog'lom odamlarnikidan farq qiladi, bu esa ichak mikrobiotasi disbiozining mavjudligini ko'rsatadi (Finegold va boshqalar, 2010). Xuddi shunday, yallig'lanishli ichak kasalliklari, semizlik, Altsgeymer kasalligi va boshqalar bilan og'rigan bemorlarning mikrobiom xususiyatlari ham sog'lom odamlarnikidan farq qiladi (Turnbaugh va boshqalar, 2009; Vogt va boshqalar, 2017; Henke va boshqalar, 2019). Biroq, bugungi kunga qadar ichak mikrobiomi va nevrologik kasalliklar yoki alomatlar o'rtasida sababiy bog'liqlik o'rnatilmagan (Yap va boshqalar, 2021), garchi bir nechta bakterial turlar ushbu kasallik holatlarining ba'zilarida rol o'ynaydi deb taxmin qilinsa ham. Masalan, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio va boshqa turkumlar autizmli bemorlarning mikrobiotasida ko'proq uchraydi (Tomova va boshqalar, 2015; Golubeva va boshqalar, 2017; Cristiano va boshqalar, 2018; Zurita va boshqalar, 2020). Shunisi e'tiborga loyiqki, ushbu turkumlarning ba'zi a'zo turlari PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq genlarga ega ekanligi ma'lum (Reichardt va boshqalar, 2014; Yun va Lee, 2016; Zhang va boshqalar, 2019; Baur va Dürre, 2023). PPA ning mikroblarga qarshi xususiyatlarini hisobga olgan holda, uning ko'pligini oshirish PPA ishlab chiqaradigan bakteriyalarning o'sishi uchun foydali bo'lishi mumkin (Jacobson va boshqalar, 2018). Shunday qilib, PFA ga boy muhit ichak mikrobiotasida, jumladan, oshqozon-ichak patogenlarida o'zgarishlarga olib kelishi mumkin, bu esa oshqozon-ichak alomatlariga olib kelishi mumkin bo'lgan omillar bo'lishi mumkin.
Mikrobiom tadqiqotlaridagi asosiy savol shundaki, mikrobial tarkibdagi farqlar asosiy kasalliklarning sababi yoki alomati hisoblanadimi. Parhez, ichak mikrobiomi va nevrologik kasalliklar o'rtasidagi murakkab bog'liqlikni aniqlashning birinchi bosqichi parhezning mikrobial tarkibga ta'sirini baholashdir. Shu maqsadda biz PPA ga boy yoki PPA ga boy parhez bilan oziqlangan sichqonlarning avlodlarining ichak mikrobiomlarini taqqoslash uchun uzoq o'qilgan metagenomik ketma-ketlikdan foydalandik. Avlodlar onalari bilan bir xil parhez bilan oziqlantirildi. Biz PPA ga boy parhez ichak mikrobial tarkibida va mikrobial funktsional yo'llarda, ayniqsa PPA metabolizmi va/yoki PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq o'zgarishlarga olib keladi, degan gipotezani ilgari surdik.
Ushbu tadqiqotda Markaziy Florida Universitetining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish instituti qo'mitasi (UCF-IACUC) ko'rsatmalariga muvofiq gliyaga xos GFAP promouteri nazorati ostida yashil lyuminestsent oqsilni (GFP) haddan tashqari ifodalovchi FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgen sichqonlari (Jackson Laboratories) ishlatilgan (Hayvonlardan foydalanish uchun ruxsatnoma raqami: PROTO202000002). Sutdan ajratilgandan so'ng, sichqonlar har bir qafasda har bir jinsdan 1-5 ta sichqon bo'lgan alohida qafaslarga joylashtirildi. Sichqonlarga ad libitum tozalangan nazorat parhezi (modifikatsiyalangan ochiq yorliqli standart parhez, 16 kkal% yog ') yoki natriy propionat qo'shilgan parhez (modifikatsiyalangan ochiq yorliqli standart parhez, 16 kkal% yog', 5000 ppm natriy propionat o'z ichiga olgan parhez) bilan berildi. Ishlatilgan natriy propionat miqdori umumiy oziq-ovqat vazniga 5000 mg PFA/kg ga teng edi. Bu oziq-ovqat konservanti sifatida foydalanish uchun tasdiqlangan PPA ning eng yuqori konsentratsiyasi. Ushbu tadqiqotga tayyorgarlik ko'rish uchun ota sichqonlar juftlashishdan 4 hafta oldin ikkala parhez bilan ham oziqlantirildi va bu parhez butun onaning homiladorligi davomida davom ettirildi. Nasl sichqonlar [22 sichqon, 9 ta nazorat guruhi (6 ta erkak, 3 ta urg'ochi) va 13 ta PPA (4 ta erkak, 9 ta urg'ochi)] sutdan ajratildi va keyin 5 oy davomida ona sichqonlar bilan bir xil parhezda davom ettirildi. Nasl sichqonlar 5 oyligida qurbon qilindi va ularning ichak najasidagi moddalar yig'ildi va dastlab 1,5 ml mikrotsentrifuga naychalarida -20°C haroratda saqlandi, so'ngra xo'jayin DNKsi tugaguncha va mikrobial nuklein kislotalar ajratib olinmaguncha -80°C muzlatgichga o'tkazildi.
Xost DNKsi o'zgartirilgan protokolga muvofiq olib tashlandi (Charalampous va boshqalar, 2019). Qisqacha aytganda, najas tarkibi 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) ga o'tkazildi va muzlatilgan holda saqlandi. Har bir ekstraktsiya uchun maksimal 1-2 najas granulasini qayta ishlang. Keyin najas tarkibi naycha ichidagi plastik pestle yordamida mexanik ravishda gomogenlashtirilib, suspenziya hosil qilindi. Namunalar 10 000 RCF da 5 daqiqa yoki namunalar granulalar hosil bo'lguncha santrifuga qiling, so'ngra supernatantni so'rib oling va granulani 250 µl 1× PBS da qayta eriting. Eukaryotik hujayra membranalarini yumshatish uchun yuvish vositasi sifatida namunaga 250 µl 4,4% saponin eritmasi (TCI, mahsulot raqami S0019) qo'shing. Namunalar silliq bo'lguncha muloyimlik bilan aralashtirildi va xona haroratida 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin, eukaryotik hujayralarni yo'q qilish uchun namunaga 350 mkl nukleazasiz suv qo'shildi, 30 soniya davomida inkubatsiya qilindi va keyin 12 mkl 5 M NaCl qo'shildi. Keyin namunalar 6000 RCF da 5 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Supernatantni so'rib oling va granulani 100 mkl 1X PBS da qayta eriting. Xost DNKsini olib tashlash uchun 100 mkl HL-SAN buferi (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleazasiz suv) va 10 mkl HL-SAN fermentini (ArticZymes P/N 70910-202) qo'shing. Namunalar pipetka yordamida yaxshilab aralashtirildi va Eppendorf™ ThermoMixer C da 37 °C da 30 daqiqa davomida 800 rpm tezlikda inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, 6000 RCF da 3 daqiqa davomida santrifüj qilindi va ikki marta 800 µl va 1000 µl 1X PBS bilan yuvildi. Nihoyat, granulani 100 µl 1X PBS da qayta eritib yuboring.
Umumiy bakterial DNK New England Biolabs Monarch Genomic DNK Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) yordamida ajratildi. To'plam bilan birga taqdim etilgan standart ish tartibi biroz o'zgartirilgan. Yakuniy elyutsiya uchun operatsiyadan oldin nukleazasiz suvni 60°C da inkubatsiya qiling va saqlang. Har bir namunaga 10 µl Proteinaza K va 3 µl RNase A qo'shing. Keyin 100 µl Hujayra Lizis Buferini qo'shing va muloyimlik bilan aralashtiring. Keyin namunalar Eppendorf™ ThermoMixer C da 56°C va 1400 rpm da kamida 1 soat va 3 soatgacha inkubatsiya qilindi. Inkubatsiya qilingan namunalar 12000 RCF da 3 daqiqa davomida santrifuga qilindi va har bir namunadagi supernatant 400 µL bog'lovchi eritmani o'z ichiga olgan alohida 1,5 ml mikrosantrifuga naychasiga o'tkazildi. Keyin naychalar 1 soniya oralig'ida 5-10 soniya davomida pulsatsiya qilindi. Har bir namunadagi barcha suyuqlik miqdorini (taxminan 600–700 µL) oqimli yig'ish naychasiga joylashtirilgan filtr kartrijiga o'tkazing. Naychalar dastlabki DNK bog'lanishi uchun 1000 µL da 3 daqiqa davomida santrifuga qilindi va keyin qoldiq suyuqlikni olib tashlash uchun 12000 µL da 1 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Namuna ustuni yangi yig'ish naychasiga o'tkazildi va keyin ikki marta yuvildi. Birinchi yuvish uchun har bir naychaga 500 µL yuvish buferi qo'shing. Naychani 3-5 marta ag'daring va keyin 12000 µL da 1 daqiqa davomida santrifuga qiling. Suyuqlikni yig'ish naychasidan to'kib tashlang va filtr kartrijini yana o'sha yig'ish naychasiga joylashtiring. Ikkinchi yuvish uchun filtrga teskari o'girmasdan 500 µL yuvish buferi qo'shing. Namunalar 12000 µL da 1 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Filtrni 1,5 ml LoBind® naychasiga o'tkazing va 100 µL oldindan qizdirilgan nukleazasiz suv qo'shing. Filtrlar xona haroratida 1 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin 12000 RCF da 1 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Elyutsiyalangan DNK -80°C da saqlandi.
DNK konsentratsiyasi Qubit™ 4.0 fluorometr yordamida aniqlandi. DNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Qubit™ 1X dsDNA yuqori sezuvchanlik to'plami (kat. № Q33231) yordamida tayyorlandi. DNK fragmentining uzunligi taqsimoti Aglient™ 4150 yoki 4200 TapeStation yordamida o'lchandi. DNK Agilent™ Genomic DNK Reagentlari (kat. № 5067-5366) va Genomic DNK ScreenTape (kat. № 5067-5365) yordamida tayyorlandi. Kutubxona tayyorlash ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) yordamida amalga oshirildi. DNK Min106D oqim xujayrasi (R 9.4.1) bilan ONT GridION™ Mk1 sekvenseri yordamida sekvensiya qilindi. Ketma-ketlik sozlamalari quyidagilar edi: yuqori aniqlikdagi bazaviy chaqiruv, minimal q qiymati 9, shtrix-kodni sozlash va shtrix-kodni kesish. Namunalar 72 soat davomida ketma-ketlikda tekshirildi, shundan so'ng asosiy qo'ng'iroq ma'lumotlari keyingi ishlov berish va tahlil qilish uchun taqdim etildi.
Bioinformatikani qayta ishlash avval tasvirlangan usullar yordamida amalga oshirildi (Greenman va boshqalar, 2024). Ketma-ketlikdan olingan FASTQ fayllari har bir namuna uchun kataloglarga bo'lindi. Bioinformatika tahlilidan oldin ma'lumotlar quyidagi quvur liniyasi yordamida qayta ishlandi: birinchidan, namunalarning FASTQ fayllari bitta FASTQ fayliga birlashtirildi. Keyin, 1000 bp dan qisqa o'qishlar Filtlong v. 0.2.1 yordamida filtrlandi, o'zgartirilgan yagona parametr –min_length 1000 bo'ldi (Wick, 2024). Keyingi filtrlashdan oldin, o'qish sifati NanoPlot v. 1.41.3 yordamida quyidagi parametrlar bilan nazorat qilindi: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster va Rademakers, 2023). O'qishlar quyidagi parametrlar bilan xost tomonidan ifloslangan o'qishlarni olib tashlash uchun minimap2 v. 2.24-r1122 yordamida sichqoncha mos yozuvlar genomiga GRCm39 (GCF_000001635.27) moslashtirildi: -L -ax map-ont(Lee, 2018). Yaratilgan hizalash fayllari samtools v. 1.16.1 da samtools view -b (Danecek va boshqalar, 2021) yordamida BAM formatiga o'zgartirildi. Keyin hizalanmagan o'qishlar samtools view -b -f 4 yordamida aniqlandi, bu esa bu o'qishlar xost genomiga tegishli emasligini ko'rsatdi. Hizalanmagan o'qishlar standart parametrlarga ega samtools bam2fq yordamida FASTQ formatiga qaytarildi. NanoPlot avval tasvirlangan sozlamalardan foydalanib, filtrlangan o'qishlarda qayta ishga tushirildi. Filtrlashdan so'ng, metagenomik ma'lumotlar metaflye v. 2.8.2-b1689 yordamida quyidagi parametrlar bilan yig'ildi: –nano-raw–meta (Kolmogorov va boshqalar, 2020). Qolgan parametrlarni standart qiymatlarida qoldiring. Yig'ishdan so'ng, filtrlangan o'qishlar minimap2 yordamida yig'ishga moslashtirildi va -ax map-ont parametri SAM formatida hizalama faylini yaratish uchun ishlatilgan. Yig'ish dastlab racon v. 1.4.20 yordamida quyidagi parametrlar bilan takomillashtirildi: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser va boshqalar, 2017). Racon tugallangandan so'ng, u medaka v. 1.7.2 yordamida medaka_consesus yordamida yanada takomillashtirildi, -m parametridan tashqari barcha parametrlar standart qiymatlarida qoldirildi. -m parametri ma'lumotlarimiz uchun ishlatiladigan oqim hujayrasi kimyosi va yuqori aniqlikdagi bazaviy chaqiruvni belgilash uchun r941_min_hac_g507 ga o'rnatildi (nanoporetech/medaka, 2024). Filtrlangan ma'lumotlar (bundan keyin mikrobial ma'lumotlar deb yuritiladi) va yakuniy tozalangan yig'ma keyingi tahlil uchun ishlatilgan.
Taksonomik tasniflash uchun o'qilgan va yig'ilgan kontiglar Kraken2 v. 2.1.2 (Wood va boshqalar, 2019) yordamida tasniflangan. O'qilgan va yig'ilgan ma'lumotlar uchun mos ravishda hisobotlar va chiqish fayllarini yarating. O'qilgan va yig'ilgan ma'lumotlarni tahlil qilish uchun –use-names parametridan foydalaning. O'qilgan segmentlar uchun –gzip-siqilgan va –juftlashtirilgan variantlar ko'rsatilgan. Metagenomlardagi taksonlarning nisbiy ko'pligi Bracken v. 2.8 (Lu va boshqalar, 2017) yordamida baholandi. Avval biz quyidagi parametrlarga ega bracken-build yordamida 1000 ta bazani o'z ichiga olgan kmer ma'lumotlar bazasini yaratdik: -d-k 35 -l 1000 Yaratilgandan so'ng, bracken kraken2 tomonidan yaratilgan hisobot asosida ishlaydi va quyidagi parametrlar yordamida ma'lumotlarni filtrlaydi: -d -I -O-p 1000 -l

Ular orasida tahlil qilinayotgan tasniflash darajasiga qarab P, G yoki S tanlanadi. Soxta musbat tasniflarning ta'sirini minimallashtirish uchun 1e-4 (1/10,000 o'qish) minimal nisbiy mo'llik chegarasi qabul qilindi. Statistik tahlildan oldin, Bracken tomonidan xabar qilingan nisbiy mo'llik (fraction_total_reads) markazlashtirilgan log-nisbat (CLR) transformatsiyasi yordamida o'zgartirildi (Aitchison, 1982). Ma'lumotlarni transformatsiya qilish uchun CLR usuli tanlangan, chunki u masshtab bo'yicha o'zgarmas va siyrak bo'lmagan ma'lumotlar to'plamlari uchun etarli (Gloor va boshqalar, 2017). CLR transformatsiyasi tabiiy logarifmadan foydalanadi. Bracken tomonidan xabar qilingan hisoblash ma'lumotlari nisbiy log ifodasi (RLE) yordamida normallashtirildi (Anders va Huber, 2010). Raqamlar matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 va ketma-ket logarifmlar kombinatsiyasi yordamida yaratildi (Gloor va boshqalar, 2017). 0.12.2 va stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier va boshqalar, 2022). Bacillus/Bacteroidetes nisbati har bir namuna uchun normallashtirilgan bakteriyalar sonidan foydalangan holda hisoblab chiqildi. Jadvallarda ko'rsatilgan qiymatlar 4 ta kasrgacha yaxlitlangan. Simpson xilma-xillik indeksi KrakenTools v. 1.2 paketida taqdim etilgan alpha_diversity.py skripti yordamida hisoblab chiqildi (Lu va boshqalar, 2022). Bracken hisoboti skriptda va -an parametri uchun Simpson indeksi "Si" berilgan. Mo'llikdagi sezilarli farqlar o'rtacha CLR farqlari ≥ 1 yoki ≤ -1 sifatida aniqlandi. O'rtacha CLR farqi ±1 bo'lsa, namuna turining mo'lligi 2,7 baravar oshganligini ko'rsatadi. (+/-) belgisi taksonning mos ravishda PPA namunasida va nazorat namunasida ko'proq ekanligini ko'rsatadi. Ahamiyat Mann-Whitney U testi yordamida aniqlandi (Virtanen va boshqalar, 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini va Hochberg, 1995; Seabold va Perktold, 2010) qo'llanildi va bir nechta sinovlarni tuzatish uchun Benjamini-Hochberg protsedurasi qo'llanildi. Statistik ahamiyatni aniqlash uchun chegara sifatida sozlangan p-qiymati ≤ 0.05 ishlatilgan.
Gen annotatsiyasi va nisbiy mo'llikni baholash Maranga va boshqalar tomonidan tasvirlangan protokolning o'zgartirilgan versiyasi yordamida amalga oshirildi (Maranga va boshqalar, 2023). Birinchidan, 500 bp dan qisqa kontiglar SeqKit v. 2.5.1 (Shen va boshqalar, 2016) yordamida barcha yig'ilishlardan olib tashlandi. Keyin tanlangan yig'ilishlar pan-metagenomaga birlashtirildi. Ochiq o'qish ramkalari (ORF) Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 ning parallel versiyasi) yordamida quyidagi parametrlar bilan aniqlandi: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett va boshqalar, 2012; Jaenicke, 2024). Olingan nukleotid fayllari barcha to'liq bo'lmagan genlarni olib tashlash uchun Python yordamida filtrlandi. Keyin CD-HIT v. 4.8.1 genlarni quyidagi parametrlar bilan klasterlash uchun ishlatilgan: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu va boshqalar, 2012). Yaratilgan ortiqcha bo'lmagan gen katalogi genlarning ko'pligi va annotatsiyasini baholash uchun ishlatilgan. Nisbiy genlarning ko'pligi KMA v. 1.4.9 (Clausen va boshqalar, 2018) yordamida baholandi. Avval quyidagi parametrlarga ega KMA indeksidan foydalanib indeks faylini yarating: -i -OKeyin, Bioinformatika Quvuri bo'limida tasvirlanganidek, har bir namuna uchun mikrobial o'qishlar bilan birga yaratilgan indeksdan foydalanib, KMA quyidagi parametrlar bilan ishga tushirildi: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Keyin, genlar soni CLR yordamida normallashtirildi va Sci-kit learn ning asosiy komponent tahlili (PCA) klassi qo'llanildi (Pedregosa va boshqalar, 2011). Bashorat qilingan gen annotatsiyasi ortiqcha bo'lmagan gen katalogida eggNOG v. 2.1.12 ning emapper.py skripti va eggNOG ma'lumotlar bazasi 5.0.2 versiyasi yordamida quyidagi parametrlar bilan amalga oshirildi: –itype CDS –cpu 24 -i– Ma'lumotlar katalogi–go_evidence Elektron bo'lmagan – chiqish– Chiqish katalogi–target_orthologs barchasi –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra va boshqalar, 2021). KMA natijalari yetarli shablon qoplamasi va shablon identifikatsiyasi (≥ 90%) va ko'pligi (chuqurligi ≥ 3) bo'lgan genlarni tanlash uchun skriningdan o'tkazildi. KMA chuqurligi natijalari yuqorida tavsiflanganidek CLR yordamida o'zgartirildi. Keyin KMA natijalari har bir gen uchun kontig manbasidan foydalangan holda funktsional annotatsiya va tasniflash natijalaridan olingan kontig identifikatorlari bilan taqqoslandi. Taksonlarda bo'lgani kabi, genlar ko'pligidagi sezilarli farqlar o'rtacha CLR farqi ≥ 1 yoki ≤ -1 bo'lgan genlar sifatida aniqlandi, bunda gen mos ravishda PPA yoki nazorat namunalarida ko'proq ekanligini ko'rsatuvchi belgi (+/-) mavjud.
Genlar dastlab eggNOG tomonidan gen yo'llarining ko'pligini taqqoslash uchun tayinlangan Kioto Genlar va Genomlar Ensiklopediyasi (KEGG) ortolog (KO) identifikatorlariga muvofiq guruhlangan. Tahlil qilishdan oldin nokautsiz yoki bir nechta nokautga uchragan genlar olib tashlandi. Keyin har bir namunadagi har bir KO ning o'rtacha ko'pligi hisoblab chiqildi va statistik tahlil o'tkazildi. PPA metabolizm genlari KEGG_Pathway ustunida ko00640 qatori berilgan har qanday gen sifatida aniqlandi, bu KEGG ga ko'ra propionat metabolizmidagi rolini ko'rsatadi. PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq deb aniqlangan genlar 1-qo'shimcha jadvalda keltirilgan (Reichardt va boshqalar, 2014; Yang va boshqalar, 2017). Har bir namunaviy turdagi PPA metabolizmi va ishlab chiqarish genlarini aniqlash uchun permutatsiya testlari o'tkazildi, ular sezilarli darajada ko'p edi. Tahlil qilingan har bir gen uchun mingta permutatsiya o'tkazildi. Statistik ahamiyatni aniqlash uchun chegara sifatida 0,05 ga teng p-qiymati ishlatilgan. Klaster ichidagi vakillik genlarining annotatsiyalari asosida klaster ichidagi individual genlarga funktsional annotatsiyalar berildi. PPA metabolizmi va/yoki PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq taksonlarni Kraken2 chiqish fayllaridagi kontig identifikatorlarini eggNOG yordamida funktsional annotatsiya paytida saqlangan bir xil kontig identifikatorlari bilan moslashtirish orqali aniqlash mumkin edi. Ahamiyatni tekshirish avval tasvirlangan Mann-Whitney U testi yordamida amalga oshirildi. Bir nechta sinovlar uchun tuzatish Benjamin-Hochberg protsedurasi yordamida amalga oshirildi. Statistik ahamiyatni aniqlash uchun chegara sifatida ≤ 0,05 p-qiymati ishlatilgan.
Sichqonlarning ichak mikrobiomining xilma-xilligi Simpson xilma-xillik indeksi yordamida baholandi. Nazorat va PPA namunalari o'rtasida jins va tur xilma-xilligi jihatidan sezilarli farqlar kuzatilmadi (jins uchun p-qiymati: 0,18, turlar uchun p-qiymati: 0,16) (1-rasm). Keyin mikrobial tarkib asosiy komponent tahlili (PCA) yordamida taqqoslandi. 2-rasmda namunalarning ularning filalari bo'yicha klasterlanishi ko'rsatilgan, bu PPA va nazorat namunalari o'rtasida mikrobiomlarning tur tarkibida farqlar borligini ko'rsatadi. Bu klasterlash jins darajasida kamroq aniqlangan, bu PPA ma'lum bakteriyalarga ta'sir qilishini ko'rsatadi (1-qo'shimcha rasm).
1-rasm. Sichqoncha ichak mikrobiomining turkumlarining alfa xilma-xilligi va tur tarkibi. PPA va nazorat namunalarida (A) va (B) turlarning Simpson xilma-xilligi indekslarini ko'rsatuvchi katakcha grafiklari. Ahamiyat Mann-Whitney U testi yordamida aniqlandi va Benjamin-Hochberg protsedurasi yordamida ko'p marta tuzatish amalga oshirildi. ns, p-qiymati ahamiyatli emas edi (p>0,05).
2-rasm. Sichqon ichak mikrobiomi tarkibining tur darajasidagi asosiy komponent tahlili natijalari. Asosiy komponent tahlili diagrammasi namunalarning dastlabki ikkita asosiy komponenti bo'yicha taqsimlanishini ko'rsatadi. Ranglar namuna turini ko'rsatadi: PPA ta'siriga uchragan sichqonlar binafsha rangda va nazorat sichqonlari sariq rangda. 1 va 2 asosiy komponentlar mos ravishda x o'qi va y o'qida chizilgan va ularning tushuntirilgan dispersiya nisbati sifatida ifodalangan.
RLE transformatsiyalangan son ma'lumotlaridan foydalangan holda, nazorat va PPA sichqonlarida mediana Bacteroidetes/Bacilli nisbatining sezilarli darajada pasayishi kuzatildi (nazorat: 9.66, PPA: 3.02; p-qiymati = 0.0011). Bu farq nazorat guruhiga nisbatan PPA sichqonlarida Bacteroidetesning yuqori miqdori bilan bog'liq edi, garchi farq sezilarli bo'lmasa ham (nazorat o'rtacha CLR: 5.51, PPA o'rtacha CLR: 6.62; p-qiymati = 0.054), Bacteroidetesning miqdori esa shunga o'xshash edi (nazorat o'rtacha CLR: 7.76, PPA o'rtacha CLR: 7.60; p-qiymati = 0.18).
Ichak mikrobiomining taksonomik a'zolarining ko'pligini tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, 1 ta filum va 77 ta tur PPA va nazorat namunalari o'rtasida sezilarli darajada farq qiladi (2-qo'shimcha jadval). PPA namunalarida 59 turning ko'pligi nazorat namunalariga qaraganda ancha yuqori bo'lgan, nazorat namunalarida esa atigi 16 turning ko'pligi PPA namunalariga qaraganda yuqori bo'lgan (3-rasm).
3-rasm. PPA va nazorat sichqonlarining ichak mikrobiomidagi taksonlarning differentsial ko'pligi. Vulkan grafiklari PPA va nazorat namunalari o'rtasida turkumlar (A) yoki turlar (B) ko'pligidagi farqlarni ko'rsatadi. Kulrang nuqtalar taksonlar ko'pligida sezilarli farq yo'qligini ko'rsatadi. Rangli nuqtalar ko'plikdagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi (p-qiymati ≤ 0,05). Namuna turlari o'rtasida ko'plikdagi eng katta farqlarga ega bo'lgan eng yaxshi 20 ta takson mos ravishda qizil va och ko'k ranglarda (nazorat va PPA namunalari) ko'rsatilgan. Sariq va binafsha nuqtalar nazorat yoki PPA namunalarida nazoratga qaraganda kamida 2,7 baravar ko'p bo'lgan. Qora nuqtalar sezilarli darajada farq qiladigan ko'plikdagi taksonlarni ifodalaydi, o'rtacha CLR farqlari -1 va 1 orasida. P qiymatlari Mann-Whitney U testi yordamida hisoblab chiqilgan va Benjamini-Hochberg protsedurasi yordamida bir nechta sinovlar uchun tuzatilgan. Qalin o'rtacha CLR farqlari ko'plikdagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi.
Ichak mikrobial tarkibini tahlil qilgandan so'ng, biz mikrobiomning funktsional annotatsiyasini amalga oshirdik. Past sifatli genlarni filtrlagandan so'ng, barcha namunalarda jami 378 355 ta noyob gen aniqlandi. Ushbu genlarning o'zgartirilgan ko'pligi asosiy komponent tahlili (PCA) uchun ishlatilgan va natijalar namunalar turlarining funktsional profillariga asoslangan holda yuqori darajada klasterlanganligini ko'rsatdi (4-rasm).
4-rasm. Sichqoncha ichak mikrobiomining funktsional profilidan foydalangan holda PCA natijalari. PCA diagrammasi namunalarning dastlabki ikkita asosiy komponenti bo'yicha taqsimlanishini ko'rsatadi. Ranglar namuna turini ko'rsatadi: PPA ta'siriga uchragan sichqonlar binafsha rangda va nazorat sichqonlari sariq rangda. 1 va 2 asosiy komponentlar mos ravishda x o'qi va y o'qida chizilgan va ularning tushuntirilgan dispersiya nisbati sifatida ifodalangan.
Keyin biz turli namunaviy turlarda KEGG nokautlarining ko'pligini o'rganib chiqdik. Jami 3648 ta noyob nokaut aniqlandi, ulardan 196 tasi nazorat namunalarida sezilarli darajada ko'p va 106 tasi PPA namunalarida ko'proq edi (5-rasm). Nazorat namunalarida jami 145 ta gen va PPA namunalarida 61 ta gen aniqlandi, ularning ko'pligi sezilarli darajada farq qiladi. Lipid va aminokislota metabolizmi bilan bog'liq yo'llar PPA namunalarida sezilarli darajada boyitilgan (3-qo'shimcha jadval). Azot metabolizmi va oltingugurt relay tizimlari bilan bog'liq yo'llar nazorat namunalarida sezilarli darajada boyitilgan (3-qo'shimcha jadval). Aminokislota/nukleotid metabolizmi (ko:K21279) va inozitol fosfat metabolizmi (ko:K07291) bilan bog'liq genlarning ko'pligi PPA namunalarida sezilarli darajada yuqori edi (5-rasm). Nazorat namunalarida benzoat metabolizmi (ko:K22270), azot metabolizmi (ko:K00368) va glikoliz/glyukoneogenez (ko:K00131) bilan bog'liq genlar sezilarli darajada ko'proq edi (5-rasm).
5-rasm. PPA va nazorat sichqonlarining ichak mikrobiomidagi KOlarning differentsial ko'pligi. Vulqon diagrammasi funktsional guruhlar (KO) ko'pligidagi farqlarni tasvirlaydi. Kulrang nuqtalar namuna turlari orasida ko'pligi sezilarli darajada farq qilmaydigan KOlarni bildiradi (p-qiymati > 0,05). Rangli nuqtalar ko'plikdagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi (p-qiymati ≤ 0,05). Namuna turlari orasidagi ko'plikdagi eng katta farqlarga ega 20 ta KO mos ravishda nazorat va PPA namunalariga mos keladigan qizil va och ko'k rangda ko'rsatilgan. Sariq va binafsha nuqtalar nazorat va PPA namunalarida mos ravishda kamida 2,7 baravar ko'p bo'lgan KOlarni bildiradi. Qora nuqtalar o'rtacha CLR farqlari -1 va 1 orasida sezilarli darajada farq qiladigan ko'plikdagi KOlarni bildiradi. P qiymatlari Mann-Whitney U testi yordamida hisoblab chiqilgan va Benjamin-Hochberg protsedurasi yordamida bir nechta taqqoslashlar uchun sozlangan. NaN KO KEGGdagi yo'lga tegishli emasligini ko'rsatadi. Qalin o'rtacha CLR farq qiymatlari ko'plikdagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi. Ro'yxatdagi KOlar tegishli bo'lgan yo'llar haqida batafsil ma'lumot olish uchun 3-qo'shimcha jadvalga qarang.
Izohlangan genlar orasida 1601 ta gen namunalar turlari orasida sezilarli darajada farq qiluvchi ko'pliklarga ega edi (p ≤ 0,05), har bir gen kamida 2,7 baravar ko'p edi. Ushbu genlardan 4 tasi nazorat namunalarida, 1597 tasi esa PPA namunalarida ko'proq edi. PPA antimikrob xususiyatlarga ega bo'lgani uchun, biz namunalar turlari orasidagi PPA metabolizmi va ishlab chiqarish genlarining ko'pligini tekshirdik. 1332 ta PPA metabolizmi bilan bog'liq genlar orasida 27 tasi nazorat namunalarida va 12 tasi PPA namunalarida ko'proq edi. 223 ta PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq genlar orasida 1 tasi PPA namunalarida sezilarli darajada ko'p edi. 6A-rasmda PPA metabolizmida ishtirok etadigan genlarning ko'proq ko'pligi, nazorat namunalarida sezilarli darajada ko'pligi va katta effekt o'lchamlari ko'rsatilgan, 6B-rasmda esa PPA namunalarida sezilarli darajada ko'pligi kuzatilgan individual genlar ta'kidlangan.
6-rasm. Sichqon ichak mikrobiomida PPA bilan bog'liq genlarning differentsial ko'pligi. Vulqon grafiklari PPA metabolizmi (A) va PPA ishlab chiqarish (B) bilan bog'liq genlarning ko'pligidagi farqlarni tasvirlaydi. Kulrang nuqtalar namunalar turlari o'rtasida ko'pligi sezilarli darajada farq qilmaydigan genlarni ko'rsatadi (p-qiymati > 0,05). Rangli nuqtalar ko'plikdagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi (p-qiymati ≤ 0,05). Ko'plikdagi eng katta farqlarga ega 20 ta gen mos ravishda qizil va och ko'k ranglarda (nazorat va PPA namunalari) ko'rsatilgan. Sariq va binafsha nuqtalarning ko'pligi nazorat va PPA namunalarida nazorat namunalariga qaraganda kamida 2,7 baravar ko'p edi. Qora nuqtalar o'rtacha CLR farqlari -1 va 1 orasida sezilarli darajada farq qiladigan ko'pliklarga ega genlarni ifodalaydi. P qiymatlari Mann-Whitney U testi yordamida hisoblab chiqilgan va Benjamin-Hochberg protsedurasi yordamida bir nechta taqqoslashlar uchun tuzatilgan. Genlar ortiqcha bo'lmagan genlar katalogidagi vakillik genlariga mos keladi. Gen nomlari KO genini bildiruvchi KEGG belgisidan iborat. Qalin o'rtacha CLR farqlari sezilarli darajada farq qiladigan ko'pliklarni ko'rsatadi. Tire (-) KEGG ma'lumotlar bazasida gen uchun hech qanday belgi yo'qligini bildiradi.
PPA metabolizmi va/yoki ishlab chiqarish bilan bog'liq genlarga ega taksonlar kontiglarning taksonomik identifikatsiyasini genning kontig identifikatori bilan moslashtirish orqali aniqlandi. Jins darajasida 130 ta turkum PPA metabolizmi bilan bog'liq genlarga va 61 ta turkum PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq genlarga ega ekanligi aniqlandi (4-qo'shimcha jadval). Biroq, hech bir turkum ko'plikda sezilarli farqlarni ko'rsatmadi (p > 0,05).
Tur darajasida 144 ta bakterial tur PPA metabolizmi bilan bog'liq genlarga va 68 ta bakterial tur PPA ishlab chiqarish bilan bog'liq genlarga ega ekanligi aniqlandi (5-qo'shimcha jadval). PPA metabolizatorlari orasida sakkizta bakteriya namunalar turlari orasida ko'plikning sezilarli darajada oshganini ko'rsatdi va ularning barchasi ta'sirda sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatdi (6-qo'shimcha jadval). Ko'plikda sezilarli farqlarga ega bo'lgan barcha aniqlangan PPA metabolizatorlari PPA namunalarida ko'proq edi. Tur darajasidagi tasniflash namunalar turlari orasida sezilarli darajada farq qilmaydigan turkum vakillarini, jumladan, bir nechta Bacteroides va Ruminococcus turlarini, shuningdek, Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus va Alcaligenes polymorpha ni aniqladi. PPA ishlab chiqaruvchi bakteriyalar orasida to'rtta bakteriya namunalar turlari orasida ko'plikda sezilarli farqlarni ko'rsatdi. Ko'plikda sezilarli farqlarga ega turlarga Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis va Ruminococcus bovis kiradi.
Ushbu tadqiqotda biz PPA ta'sirining sichqonlarning ichak mikrobiotasiga ta'sirini o'rganib chiqdik. PPA bakteriyalarda turli xil reaksiyalarni keltirib chiqarishi mumkin, chunki u ma'lum turlar tomonidan ishlab chiqariladi, boshqa turlar tomonidan oziq-ovqat manbai sifatida ishlatiladi yoki mikroblarga qarshi ta'sirga ega. Shuning uchun, uni parhez qo'shimchasi orqali ichak muhitiga qo'shish bardoshlilik, sezuvchanlik va uni ozuqa manbai sifatida ishlatish qobiliyatiga qarab turli xil ta'sirga ega bo'lishi mumkin. Sezgir bakterial turlar yo'q qilinishi va PPAga nisbatan ko'proq chidamli yoki uni oziq-ovqat manbai sifatida ishlata oladiganlar bilan almashtirilishi mumkin, bu esa ichak mikrobiotasi tarkibida o'zgarishlarga olib keladi. Bizning natijalarimiz mikrobial tarkibda sezilarli farqlarni aniqladi, ammo umumiy mikrobial xilma-xillikka ta'sir ko'rsatmadi. Eng katta ta'sirlar tur darajasida kuzatildi, PPA va nazorat namunalari o'rtasida 70 dan ortiq taksonlar miqdori sezilarli darajada farq qildi (2-qo'shimcha jadval). PPA ta'sirida bo'lgan namunalar tarkibini keyingi baholash ta'sirlanmagan namunalarga nisbatan mikrobial turlarning ko'proq heterojenligini aniqladi, bu PPA bakteriyalarning o'sish xususiyatlarini yaxshilashi va PPAga boy muhitda omon qolishi mumkin bo'lgan bakteriyalar populyatsiyasini cheklashi mumkinligini ko'rsatadi. Shunday qilib, PPA ichak mikrobiotasining xilma-xilligini keng tarqalgan buzilishlarga olib kelish o'rniga tanlab o'zgarishlarni keltirib chiqarishi mumkin.
PPA kabi oziq-ovqat konservantlari ilgari umumiy xilma-xillikka ta'sir qilmasdan ichak mikrobiomi komponentlarining ko'pligini o'zgartirishi ko'rsatilgan (Nagpal va boshqalar, 2021). Bu yerda biz PPA ta'siriga uchragan sichqonlarda sezilarli darajada boyitilgan Bacteroidetes filumidagi (ilgari Bacteroidetes nomi bilan tanilgan) Bacteroidetes turlari o'rtasidagi eng sezilarli farqlarni kuzatdik. Bacteroides turlarining ko'pligi shilimshiqning parchalanishining ko'payishi bilan bog'liq bo'lib, bu infektsiya xavfini oshirishi va yallig'lanishni kuchaytirishi mumkin (Cornick va boshqalar, 2015; Desai va boshqalar, 2016; Penzol va boshqalar, 2019). Bir tadqiqotda Bacteroides fragilis bilan davolangan yangi tug'ilgan erkak sichqonlar autizm spektrining buzilishini (ASD) eslatuvchi ijtimoiy xatti-harakatlarni namoyon etishi aniqlandi (Carmel va boshqalar, 2023) va boshqa tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Bacteroides turlari immunitet faolligini o'zgartirishi va otoimmun yallig'lanishli kardiyomiyopatiyaga olib kelishi mumkin (Gil-Cruz va boshqalar, 2019). Ruminococcus, Prevotella va Parabacteroides turkumlariga mansub turlar ham PPA ta'siriga uchragan sichqonlarda sezilarli darajada ko'paygan (Coretti va boshqalar, 2018). Ruminococcusning ayrim turlari yallig'lanishga qarshi sitokinlar ishlab chiqarish orqali Kron kasalligi kabi kasalliklar bilan bog'liq (Henke va boshqalar, 2019), Prevotella humani kabi Prevotella turlari esa gipertenziya va insulin sezgirligi kabi metabolik kasalliklar bilan bog'liq (Pedersen va boshqalar, 2016; Li va boshqalar, 2017). Nihoyat, biz Bacteroidetes (ilgari Firmicutes nomi bilan tanilgan) ning Bacteroidetes ga nisbati PPA ta'siriga uchragan sichqonlarda nazorat sichqonlariga qaraganda ancha past ekanligini aniqladik, chunki Bacteroidetes turlarining umumiy miqdori yuqori. Bu nisbat ilgari ichak gomeostazining muhim ko'rsatkichi ekanligi ko'rsatilgan va bu nisbatdagi buzilishlar turli xil kasallik holatlari bilan bog'liq (Turpin va boshqalar, 2016; Takezawa va boshqalar, 2021; An va boshqalar, 2023), jumladan, yallig'lanishli ichak kasalliklari bilan bog'liq (Stojanov va boshqalar, 2020). Umuman olganda, Bacteroidetes filumining turlari yuqori dietali PPA dan eng kuchli ta'sirlangan ko'rinadi. Bu PPA ga yuqori bardoshlik yoki PPA dan energiya manbai sifatida foydalanish qobiliyati bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu kamida bitta tur, Hoylesella enocea uchun to'g'ri ekanligi ko'rsatilgan (Hitch va boshqalar, 2022). Shu bilan bir qatorda, onaning PPA ta'siri sichqon avlodlarining ichaklarini Bacteroidetes kolonizatsiyasiga ko'proq moyil qilish orqali homila rivojlanishini kuchaytirishi mumkin; ammo, bizning tadqiqot dizaynimiz bunday baholashga imkon bermadi.
Metagenomik tarkibni baholash PPA metabolizmi va ishlab chiqarishi bilan bog'liq genlarning ko'pligida sezilarli farqlarni aniqladi, PPA ta'siriga uchragan sichqonlarda PPA ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lgan genlarning ko'pligi yuqori bo'ldi, PPA ta'siriga uchramagan sichqonlarda esa PAA metabolizmi uchun mas'ul bo'lgan genlarning ko'pligi yuqori bo'ldi (6-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, PPA ning mikrobial tarkibga ta'siri faqat uning ishlatilishi bilan bog'liq bo'lmasligi mumkin, aks holda PPA metabolizmi bilan bog'liq genlarning ko'pligi PPA ta'siriga uchragan sichqonlarning ichak mikrobiomida yuqori ko'plikni ko'rsatishi kerak edi. Buning bir sababi shundaki, PPA bakteriyalarning ko'pligini asosan bakteriyalar tomonidan ozuqa moddasi sifatida foydalanish orqali emas, balki uning antimikrobiyal ta'siri orqali vositachilik qiladi. Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, PPA Salmonella Typhimurium o'sishini dozaga bog'liq ravishda inhibe qiladi (Jacobson va boshqalar, 2018). PPA ning yuqori konsentratsiyalariga ta'sir qilish uning antimikrobiyal xususiyatlariga chidamli bo'lgan va uni metabolizatsiya qila olmaydigan yoki ishlab chiqara olmaydigan bakteriyalarni tanlashi mumkin. Masalan, bir nechta Parabacteroides turlari PPA namunalarida sezilarli darajada yuqori miqdorda ko'plik ko'rsatdi, ammo PPA metabolizmi yoki ishlab chiqarish bilan bog'liq genlar aniqlanmadi (2, 4 va 5-qo'shimcha jadvallar). Bundan tashqari, fermentatsiya qo'shimcha mahsuloti sifatida PPA ishlab chiqarilishi turli bakteriyalar orasida keng tarqalgan (Gonzalez-Garcia va boshqalar, 2017). Bakterial xilma-xillikning yuqoriligi nazorat namunalarida PPA metabolizmi bilan bog'liq genlarning ko'proq miqdorda bo'lishining sababi bo'lishi mumkin (Averina va boshqalar, 2020). Bundan tashqari, 1332 ta genning faqat 27 tasi (2,14%) faqat PPA metabolizmi bilan bog'liq genlar bo'lishi taxmin qilingan. PPA metabolizmi bilan bog'liq ko'plab genlar boshqa metabolik yo'llarda ham ishtirok etadi. Bu PPA metabolizmida ishtirok etadigan genlarning ko'pligi nazorat namunalarida yuqoriroq ekanligini yana bir bor ko'rsatadi; bu genlar qo'shimcha mahsulot sifatida PPA dan foydalanish yoki hosil bo'lishiga olib kelmaydigan yo'llarda ishlashi mumkin. Bu holda, PPA hosil bo'lishi bilan bog'liq faqat bitta gen namunalar turlari o'rtasida ko'plikda sezilarli farqlarni ko'rsatdi. PPA metabolizmi bilan bog'liq genlardan farqli o'laroq, PPA ishlab chiqarish uchun marker genlar tanlangan, chunki ular PPA ishlab chiqarishning bakterial yo'lida bevosita ishtirok etadi. PPA ta'siriga uchragan sichqonlarda barcha turlarning soni va PPA ishlab chiqarish qobiliyati sezilarli darajada oshganligi aniqlandi. Bu PPAlar PPA ishlab chiqaruvchilarni tanlaydi va shuning uchun PPA ishlab chiqarish quvvati oshishini bashorat qiladi degan bashoratni qo'llab-quvvatlaydi. Biroq, genlarning ko'pligi genlarning ifodalanishi bilan bog'liq emas; shuning uchun, nazorat namunalarida PPA metabolizmi bilan bog'liq genlarning ko'pligi yuqori bo'lsa-da, ifoda darajasi boshqacha bo'lishi mumkin (Shi va boshqalar, 2014). PPA ishlab chiqaruvchi genlarning tarqalishi va PPA ishlab chiqarish o'rtasidagi bog'liqlikni tasdiqlash uchun PPA ishlab chiqarishda ishtirok etadigan genlarning ifodasini o'rganish kerak.
PPA va nazorat metagenomlarining funktsional annotatsiyasi ba'zi farqlarni aniqladi. Gen tarkibining PCA tahlili PPA va nazorat namunalari o'rtasida alohida klasterlarni aniqladi (5-rasm). Namuna ichidagi klasterlash shuni ko'rsatdiki, nazorat genining tarkibi yanada xilma-xil, PPA namunalari esa bir-biriga klasterlangan. Gen tarkibi bo'yicha klasterlash tur tarkibi bo'yicha klasterlash bilan taqqoslanadigan edi. Shunday qilib, yo'llarning ko'pligidagi farqlar ulardagi ma'lum turlar va shtammlarning ko'pligidagi o'zgarishlarga mos keladi. PPA namunalarida sezilarli darajada yuqori ko'plikka ega ikkita yo'l aminokislota/nukleotid shakar metabolizmi (ko:K21279) va bir nechta lipid metabolizmi yo'llari (ko:K00647, ko:K03801; 3-qo'shimcha jadval) bilan bog'liq edi. ko:K21279 bilan bog'liq genlar PPA namunalarida turlar soni ancha yuqori bo'lgan turkumlardan biri bo'lgan Bacteroides turi bilan bog'liqligi ma'lum. Ushbu ferment kapsula polisaxaridlarini ifodalash orqali immun javobidan qochishi mumkin (Wang va boshqalar, 2008). Bu PPA ta'siriga uchragan sichqonlarda kuzatilgan bakteroidlarning ko'payishini tushuntirishi mumkin. Bu PPA mikrobiomida kuzatilgan yog 'kislotalari sintezining kuchayishini to'ldiradi. Bakteriyalar yog' kislotalarini ishlab chiqarish uchun FASIIko:K00647 (fabB) yo'lidan foydalanadilar, bu esa xo'jayin metabolik yo'llariga ta'sir qilishi mumkin (Yao va Rock, 2015; Johnson va boshqalar, 2020) va lipid metabolizmidagi o'zgarishlar neyrorivojlanishda rol o'ynashi mumkin (Yu va boshqalar, 2020). PPA namunalarida ko'p miqdorda oshganini ko'rsatadigan yana bir yo'l steroid gormonlari biosintezi edi (ko:K12343). Ichak mikrobiotasining gormonlar darajasiga ta'sir qilish va gormonlar ta'siriga tushish qobiliyati o'rtasida teskari bog'liqlik borligiga oid dalillar ko'payib bormoqda, ya'ni steroidlarning yuqori darajasi sog'liq uchun keyingi oqibatlarga olib kelishi mumkin (Tetel va boshqalar, 2018).
Ushbu tadqiqot cheklovlar va mulohazalardan xoli emas. Muhim farq shundaki, biz hayvonlarning fiziologik baholarini o'tkazmadik. Shuning uchun, mikrobiomdagi o'zgarishlar biron bir kasallik bilan bog'liqmi yoki yo'qmi, to'g'ridan-to'g'ri xulosa chiqarishning iloji yo'q. Yana bir mulohaza shundaki, ushbu tadqiqotdagi sichqonlar onalari bilan bir xil parhez bilan oziqlangan. Kelajakdagi tadqiqotlar PPA ga boy parhezdan PPAsiz parhezga o'tish uning mikrobiomga ta'sirini yaxshilaydimi yoki yo'qligini aniqlashi mumkin. Bizning tadqiqotimizning bir cheklovi, boshqa ko'plab tadqiqotlar singari, cheklangan namuna hajmidir. To'g'ri xulosalar chiqarish mumkin bo'lsa-da, kattaroq namuna hajmi natijalarni tahlil qilishda ko'proq statistik kuch beradi. Shuningdek, biz ichak mikrobiomidagi o'zgarishlar va har qanday kasallik o'rtasidagi bog'liqlik haqida xulosa chiqarishda ehtiyotkor bo'lamiz (Yap va boshqalar, 2021). Yosh, jins va parhez kabi chalkash omillar mikroorganizmlar tarkibiga sezilarli ta'sir ko'rsatishi mumkin. Bu omillar adabiyotlarda ichak mikrobiomining murakkab kasalliklar bilan bog'liqligi haqidagi kuzatilgan nomuvofiqliklarni tushuntirishi mumkin (Johnson va boshqalar, 2019; Lagod va Naser, 2023). Masalan, Bacteroidetes jinsi a'zolari ASD bilan kasallangan hayvonlar va odamlarda ko'paygan yoki kamayganligi ko'rsatilgan (Angelis va boshqalar, 2013; Kushak va boshqalar, 2017). Xuddi shunday, yallig'lanishli ichak kasalliklari bo'lgan bemorlarda ichak tarkibini o'rganish bir xil taksonlarda ham ko'payish, ham kamayishni aniqladi (Walters va boshqalar, 2014; Forbes va boshqalar, 2018; Upadhyay va boshqalar, 2023). Jinsga tarafkashlikning ta'sirini cheklash uchun biz jinslarning teng vakilligini ta'minlashga harakat qildik, shunda farqlar, ehtimol, parhez bilan bog'liq edi. Funktsional annotatsiyaning bir qiyinchiligi ortiqcha gen ketma-ketliklarini olib tashlashdir. Bizning gen klasterlash usulimiz noto'g'ri klasterlashni bartaraf etish uchun 95% ketma-ketlik identifikatsiyasini va 85% uzunlik o'xshashligini, shuningdek, 90% hizalanishni talab qiladi. Biroq, ba'zi hollarda biz bir xil annotatsiyalarga ega COGlarni kuzatdik (masalan, MUT) (6-rasm). Ushbu ortologlar farq qiladimi, ma'lum turlar bilan bog'liqmi yoki bu genlarni klasterlash yondashuvining cheklovimi yoki yo'qligini aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Funksional annotatsiyaning yana bir cheklovi - bu noto'g'ri tasniflashning mumkinligi; bakterial mmdA geni propionat sintezida ishtirok etadigan ma'lum ferment, ammo KEGG uni propionat metabolik yo'li bilan bog'lamaydi. Aksincha, scpB va mmcD ortologlari bir-biriga bog'liq. Belgilangan nokautlarga ega bo'lmagan genlarning ko'pligi genlarning ko'pligini baholashda PPA bilan bog'liq genlarni aniqlay olmaslikka olib kelishi mumkin. Kelajakdagi tadqiqotlar metatranskriptom tahlilidan foyda ko'radi, bu ichak mikrobiotasining funktsional xususiyatlarini chuqurroq tushunishga va genlarning ifodasini potentsial pastga tushadigan ta'sirlar bilan bog'lashga imkon beradi. Muayyan neyrorivojlanish buzilishlari yoki yallig'lanishli ichak kasalliklari bilan bog'liq tadqiqotlar uchun mikrobiom tarkibidagi o'zgarishlarni ushbu kasalliklar bilan bog'lash uchun hayvonlarning fiziologik va xulq-atvorini baholash kerak. Ichak mikrobiomini mikrobsiz sichqonlarga ko'chirib o'tkazish bo'yicha qo'shimcha tadqiqotlar ham mikrobiom kasallikning qo'zg'atuvchisi yoki xususiyati ekanligini aniqlash uchun foydali bo'ladi.
Xulosa qilib aytganda, biz parhez PPA ichak mikrobiotasining tarkibini o'zgartirishda omil bo'lib xizmat qilishini ko'rsatdik. PPA - bu turli xil oziq-ovqat mahsulotlarida keng tarqalgan bo'lib, uzoq muddatli ta'sir qilish normal ichak florasining buzilishiga olib kelishi mumkin bo'lgan FDA tomonidan tasdiqlangan konservant. Biz bir nechta bakteriyalarning ko'pligida o'zgarishlarni aniqladik, bu PPA ichak mikrobiotasining tarkibiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatadi. Mikrobiotadagi o'zgarishlar ma'lum metabolik yo'llar darajasining o'zgarishiga olib kelishi mumkin, bu esa mezbon sog'liq uchun muhim bo'lgan fiziologik o'zgarishlarga olib kelishi mumkin. Parhez PPA ning mikrobial tarkibga ta'siri disbioz yoki boshqa kasalliklarga olib kelishi mumkinligini aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Ushbu tadqiqot PPA ning ichak tarkibiga ta'siri inson salomatligiga qanday ta'sir qilishi mumkinligi bo'yicha kelajakdagi tadqiqotlar uchun asos yaratadi.
Ushbu tadqiqotda taqdim etilgan ma'lumotlar to'plamlari onlayn omborlarda mavjud. Ombor nomi va kirish raqami: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ushbu hayvonlar ustida o'tkazilgan tadqiqot Markaziy Florida Universitetining Hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha institutsional qo'mitasi (UCF-IACUC) tomonidan tasdiqlangan (Hayvonlardan foydalanish uchun ruxsatnoma raqami: PROTO202000002). Ushbu tadqiqot mahalliy qonunlar, qoidalar va institutsional talablarga javob beradi.
NG: Kontseptualizatsiya, Ma'lumotlarni boshqarish, Rasmiy tahlil, Tadqiqot, Metodologiya, Dasturiy ta'minot, Vizualizatsiya, Yozish (asl qoralama), Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash). LA: Kontseptualizatsiya, Ma'lumotlarni boshqarish, Metodologiya, Resurslar, Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash). SH: Rasmiy tahlil, Dasturiy ta'minot, Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash). SA: Tadqiqot, Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash). Bosh sudya: Tadqiqot, Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash). SN: Kontseptualizatsiya, Loyiha boshqaruvi, Resurslar, Nazorat, Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash). TA: Kontseptualizatsiya, Loyiha boshqaruvi, Nazorat, Yozish (ko'rib chiqish va tahrirlash).
Mualliflar ushbu maqolani tadqiq qilish, mualliflik qilish va/yoki nashr etish uchun hech qanday moliyaviy yordam olmaganliklarini e'lon qilishdi.
Mualliflar tadqiqot manfaatlar to'qnashuvi sifatida talqin qilinishi mumkin bo'lgan biron bir tijorat yoki moliyaviy munosabatlar mavjud bo'lmagan holda o'tkazilganligini ta'kidlaydilar. Bu qo'llanilmaydi.
Ushbu maqolada ifodalangan barcha fikrlar faqat mualliflarning fikrlarini ifodalaydi va ularning muassasalari, nashriyotchilari, muharrirlari yoki sharhlovchilarining fikrlarini aks ettirishi shart emas. Ushbu maqolada baholangan har qanday mahsulotlar yoki ularning ishlab chiqaruvchilari tomonidan bildirilgan har qanday da'volar nashriyot tomonidan kafolatlanmaydi yoki qo'llab-quvvatlanmaydi.
Ushbu maqola uchun qo'shimcha materiallarni onlayn tarzda topishingiz mumkin: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propion kislotasi autizm spektri buzilishlarida PTEN/AKT yo'lini tartibga solish orqali glioz va neyroyallig'lanishni keltirib chiqaradi. Ilmiy hisobotlar 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Tarkibiy ma'lumotlarning statistik tahlili. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Ko'krak bezi saratoni uchun xavf omili sifatida Firmicutes/Bacteroidetes nisbati. Klinik tibbiyot jurnali, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Ketma-ketlik soni ma'lumotlarining differentsial ifoda tahlili. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI va boshqalar. (2013). Autizm va keng tarqalgan rivojlanish buzilishi bo'lgan bolalarda najas mikrobiotasi va metabolomi boshqacha ko'rsatilmagan. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Autizm spektri buzilishlari bo'lgan yosh bolalarda ichak mikrobiotasining bakterial neyrometabolik xususiyatlari. Tibbiy mikrobiologiya jurnali 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom inson organi sifatida. Klinik mikrobiologiya va infeksiya 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Propion kislotasi ishlab chiqaruvchi bakteriyalar fiziologiyasiga yangicha qarashlar: Anaerotignum propionicum va Anaerotignum neopropionicum (avvalgi Clostridium propionicum va Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmlar 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spenser TE, Vu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Onaning ovqatlanishi va homila rivojlanishi. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., va Hochberg, J. (1995). Soxta ijobiy natijalarni nazorat qilish: Ko'p martali test o'tkazishga amaliy va samarali yondashuv. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x