Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS uchun cheklangan qo'llab-quvvatlash mavjud. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz namoyish qilamiz.
Umurtqali hayvonlardan farqli o'laroq, hasharotlarda erkaklarga xos jinsiy steroid gormonlari yetishmaydi deb keng tarqalgan. Anopheles gambiae da ekdizon steroidi 20-gidroksiekdizon (20E) urg'ochilar tomonidan sintez qilinganda tuxum rivojlanishini nazorat qilish va erkaklar tomonidan jinsiy yo'l bilan o'tkazilganda juftlashishga chidamli davrni keltirib chiqarish uchun evolyutsiyaga uchragan ko'rinadi3. Tuxum rivojlanishi va juftlashish muhim reproduktiv xususiyatlar bo'lganligi sababli, urg'ochi Anopheles chivinlari bu gormonal signallarni qanday integratsiya qilishini tushunish yangi bezgakni nazorat qilish dasturlarini ishlab chiqishga yordam berishi mumkin. Bu yerda biz ushbu reproduktiv funktsiyalar ekdisteroidni faollashtiruvchi/inaktivlashtiruvchi fermentlarning murakkab tarmog'i orqali turli jinsiy steroidlar tomonidan tartibga solinishini ko'rsatamiz. Biz erkaklarga xos oksidlangan ekdizon, 3-dehidro-20E (3D20E) ni aniqladik, u jinsiy yo'l bilan o'tgandan keyin ayollarning jinsiy qabul qilinishini to'xtatib, defosforlanish orqali faollashishi orqali ota-onalikni himoya qiladi. Shunisi e'tiborga loyiqki, 3D20E o'tkazilishi, shuningdek, Plazmodium infektsiyasi paytida tuxum rivojlanishini saqlaydigan reproduktiv genlarning ifodasini keltirib chiqardi va bu yuqtirilgan urg'ochilarning sog'lig'ini ta'minladi. Urg'ochi chivinlardan olingan 20E shunday qiladi. jinsiy reaksiyani keltirib chiqarmaydi, balki 20E-inhibitor kinazalar inhibe qilinganidan keyin juftlashuvchi shaxslarga tuxum qo'yishga imkon beradi. Ushbu erkakka xos hasharot steroid gormonining aniqlanishi va uning ayollarning jinsiy retseptivligini, tug'ish qobiliyatini va Plazmodium bilan o'zaro ta'sirini tartibga solishdagi roli bezgak yuqtiruvchi chivinlarning reproduktiv muvaffaqiyatini pasaytirish potentsialini ko'rsatadi.
Bezgak holatlari va o'lim holatlari yana ko'paymoqda4, chunki inson bezgagi parazitlarining yagona vektori bo'lgan Anopheles chivinlarida keng tarqalgan insektitsidlarga chidamlilik mavjud. Bu chivinlarning juftlashish biologiyasi bezgakka qarshi kurashning yangi choralari uchun ayniqsa jozibador nishon hisoblanadi, chunki urg'ochilari faqat bir marta juftlashadi5; bu bitta juftlashish hodisasini steril qilish dala sharoitida chivin populyatsiyasini kamaytirish uchun katta salohiyatga ega bo'ladi.
Ayollar erkaklardan yuqori titrli steroid gormonlarini qabul qilgandan so'ng jinsiy jihatdan nogiron bo'lib qoladilar. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, keyingi juftlashishda qiyinchilik tug'diradigan omil 20-gidroksiekdizon (20E) bo'lib, u lichinka bosqichidagi eritish siklini regulyatori sifatida ko'proq ma'lum bo'lgan steroid gormondir. Erkaklarning 20E ni sintez qilish va uzatish qobiliyati, xususan, Afrikada tarqalgan va bezgakning eng xavfli vektorlarini, jumladan, Anopheles gambiae ni o'z ichiga olgan Cellia7 subgenusining bir qismi bo'lgan Anopheles turlarida rivojlangan. Bu ayniqsa diqqatga sazovordir, chunki bu turlarda urg'ochilar har bir qon oqimidan keyin 20E ishlab chiqaradilar va 20E oogenez siklini boshqaradi (8-havolaga qarang). Biroq, urg'ochilar ekdizonning ikki xil manbasidan (erkaklarning o'tishi va qon oqimini induktsiya qilish) signallarni o'zlarining juftlashish qobiliyatiga putur yetkazmasdan qanday integratsiya qilishlari haqida kam narsa ma'lum. Aslida, agar urg'ochilar tomonidan ishlab chiqarilgan 20E jinsiy murosasizlikni qo'zg'atsa, bu bokiralik bilan oziqlanadigan odamlarda bepushtlikka olib keladi, bu bu chivinlarda juda keng tarqalgan xatti-harakatlardir5.
Mumkin bo'lgan tushuntirish shundaki, A. gambiae erkaklari modifikatsiyalangan erkakka xos ekdizonni o'tkazadi, bu esa urg'ochi reproduktiv traktida signalizatsiya kaskadini faollashtiradi va natijada juftlashish beqarorligiga olib keladi. Biroq, umurtqali hayvonlarda estrogen va androgen kabi bir nechta steroid gormonlar mavjud bo'lsa-da (9-havolada ko'rib chiqilgan), bizning ma'lumotimizga ko'ra, androgenga asoslangan steroidlar hasharotlarda aniqlanmagan.
Biz jinsiy jihatdan yetuk A. gambiae ning erkak erkak aksessuar bezidagi (MAG) steroid gormonlar repertuarini aniqlashga kirishdik, bunda modifikatsiya qiluvchi steroidlarni qidirdik. Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasini tandem massa spektrometriyasi (HPLC-MS/MS) bilan birgalikda ilgari qo'llanilgan kamroq o'ziga xos usul o'rniga qo'llagan holda, biz ushbu to'qimada ekdizon (E) va 20E ni aniqladik, bu avvalgi natijani tasdiqladi. Biroq, namunada 3-degidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 formulasiga mos keladigan oksidlangan fosforillangan steroidlar ustunlik qildi (1-rasm). Boshqa shakllarga 3-degidro-20E (3D20E) va 20E-22-fosfat (20E22P) kiradi. 3D20E22P ning HPLC-MS/MS signal intensivligi uning defosforillangan shakli 3D20E dan ikki baravar yuqori va E va 20E dan uch baravar yuqori edi (1-rasm). Garchi boshqa qismlarida... tana va pastki reproduktiv trakt (LRT; Kengaytirilgan ma'lumotlar 1a-rasm). Shuningdek, biz yangi yopilgan (<1 kunlik) erkaklar va urg'ochilarda ekdisteroidlarni tahlil qildik va faqat MAGda 3D20E va 3D20E22P ni aniqladik; E, 20E va 20E22P ikkala jinsda ham mavjud edi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1b-rasm). Bu ma'lumotlar A. gambiae ning kattalar erkaklari o'zlarining MAGlarida urg'ochilar tomonidan sintez qilinmaydigan yuqori titrli modifikatsiya qiluvchi gormonlar ishlab chiqarishini ko'rsatadi.
MAG va urg'ochi LRT (shu jumladan, atriya, urug' pufakchalari va parovarium) 4 kunlik (4 kunlik) bokira erkaklar va bokira va juftlashgan urg'ochi hayvonlardan (0,5, 3 va 12 ot kuchi) ajratildi. Ushbu to'qimalardagi ekdizon HPLC-MS/MS yordamida tahlil qilindi (o'rtacha ± semirish; juftlashtirilmagan t-test, ikki tomonlama, noto'g'ri kashfiyot darajasi (FDR) tuzatilgan; NS, ahamiyatli emas; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 soat va 0,5 soat, P = 0,035; 12 soat va 3 soat, P = 0,0015; 12 soat va 0,5 soat, P = 0,030. 3D20E22P: 3 soat va 0,5 soat, P = 0,25; 12 soat va 3 soat, P = 0.0032; 12 soat va 0.5 soat, P = 0.015). Ma'lumotlar uchta biologik replikatsiyadan olingan. Har bir qiziqish uyg'otadigan ekdizon uchun eng yuqori maydon hisoblab chiqilgan va chivinlar soni bilan normallashtirilgan. Ekdizon quyidagicha rang bilan ifodalanadi: E, yashil; 20E, to'q sariq; 20E22P, binafsha; 3D20E, ko'k; 3D20E22P, pushti. Qo'shimcha y o'qidagi shkalani oshirib, ekdizonning pastroq darajasini ko'rsatadi.
3D20E22P va 3D20E juftlashish paytida uzatilishini tekshirish uchun biz juftlashgandan keyingi turli vaqt nuqtalarida urg'ochi LRTlarni ajratdik. Ekdizon bokiralarda topilmagan bo'lsa-da, biz juftlashgandan so'ng darhol LRTda (juftlashgandan 0,5 soat o'tgach, hpm) 3D20E22P ning sezilarli miqdorini kuzatdik, vaqt o'tishi bilan kamayib bordi, 3D20E darajasi esa sezilarli darajada oshdi (1-rasm). Kimyoviy sintezlangan 3D20E dan standart sifatida foydalanib, biz juftlashgan LRTlardagi ushbu steroid gormon darajasi 20E dan kamida 100 baravar yuqori ekanligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar jadvali 1). Shunday qilib, 3D20E22P juftlashish paytida urg'ochi LRT ga uzatiladigan asosiy erkak ekdizon bo'lib, uning defosforlangan shakli, 3D20E, juftlashgandan ko'p o'tmay juda ko'p miqdorda bo'ladi. Bu oxirgi ekdizonning urg'ochi juftlashgandan keyingi biologiyada muhim rol o'ynashini ko'rsatadi.
Maxsus tuzilgan bioinformatika quvur liniyasidan foydalanib, yangi RNK ketma-ketligi (RNK-seq) ma'lumotlar to'plamini (2a-rasm) yaratgandan so'ng, biz ekdizon kinazasini (EcK), ekdizon oksidazasini (EO) va 20E-modifikatsiyalangan fosfataza genini kodlovchi ekdizonni qidirdik. EPP) reproduktiv to'qimalarda ifodalanadi. Biz bitta nomzod EPP genini va ikkita potentsial EcK genini (EcK1 va EcK2) aniqladik, ammo yaxshi nomzod EO genini topa olmadik. Shunisi e'tiborga loyiqki, individual EPP genlari Gambiya MAGlarida yuqori darajada (98,9-persentil) ifodalangan, ammo ayol LRTlarida emas (2b-rasm), bu bizning kutganimizga zid edi, chunki bu ayol to'qimasida 3D20E22P ning defosforillanishi sodir bo'lgan. Shuning uchun, biz erkak EPP juftlashish paytida uzatilishi mumkin deb hisoblaymiz. Darhaqiqat, biz juftlashgandan keyin ayol oqsilini niqoblash uchun in vivo barqaror izotop yorlig'idan foydalandik, bu ferment ayol atriumida MS tomonidan aniqlangan (rasm). 2c va 1-qo'shimcha jadval). MAG va juftlashgan (lekin bokira bo'lmagan) ayol LRT da EPP mavjudligi ham o'ziga xos antikorlar yordamida tasdiqlangan (2d-rasm).
a, Har bir jinsning reproduktiv to'qimalarida EcK, EO va EPP kodlovchi genlarni qidirish uchun maxsus yaratilgan bioinformatika quvur liniyasi. O'qlar yonidagi raqamlar har bir bosqichda erkak va ayol nomzodlar sonini ko'rsatadi. Ushbu tahlil erkaklarda ifodalangan bitta EPP geni (EPP) va bitta EcK geni (EcK1) va ikkala jinsda ham ifodalangan, ammo nomzod EO geni bermaydigan bitta EcK geni (EcK2) ni aniqladi.b, Bokira (V) va juftlashuvchi (M) Anopheles gambiae va Anopheles albicans to'qimalarida nomzod gen ifodasini taqqoslaydigan issiqlik xaritasi. Spca, urug'lantirish; MAGs, erkaklarda yordamchi bezlar; tananing boshqa qismlari, jumladan, ko'krak, qanotlar, oyoqlar, yog 'tanalar va ikkala jinsdagi ichki organlar, ayollarda tuxumdonlar. EcK2 Gambiyaning MAG va atriyalarida yuqori darajada ifodalangan, EPP esa faqat MAG.c da uchraydi. Erkak ejakulyatsiya guruhining ayol atriyalariga 3, 12 va 24 ot kuchida translokatsiyasining proteomik tahlili, bu eng ko'p uchraydigan 67 ta oqsilni ko'rsatadi. Urg'ochilar barcha oqsillarni belgilash (va niqoblash) uchun 15N dan iborat parhezda o'stirildi. Belgilanmagan erkaklar belgilangan urg'ochilar bilan juftlashtirildi va urg'ochi LRTlar proteomik tahlil uchun 3, 12 va 24 ot kuchida ajratildi (ejakulyatsiya oqsillarining to'liq ro'yxati uchun 1-qo'shimcha jadvalga qarang). Bokira erkaklarning MAGida ushbu to'qimalarning proteomik tahlili orqali EPP, Eck1 va EcK2 aniqlandi.d, EPP juftlashgan urg'ochilarning MAG va LRT da g'arbiy blot yordamida aniqlandi, ammo bokira ayollarda yoki erkaklarda yoki ayolning qolgan qismida emas. tanasi. Membranlar bir vaqtning o'zida anti-aktin (yuklanishni nazorat qilish) va anti-EPP antikorlari bilan tekshirildi. Barcha erkaklar bokira. Gel manbalari ma'lumotlari uchun 1-qo'shimcha rasmga qarang. Western blotlar ikki marta o'tkazildi va shunga o'xshash natijalarga erishildi.
EPP ning ekdisteroid fosfofosfataza faolligi MAG dan ajratilgan 3D20E22P bilan HPLC-MS/MS yordamida inkubatsiyadan so'ng tekshirildi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2a-rasm). Bundan tashqari, biz RNK vositachiligidagi interferentsiya (RNAi) orqali EPP ni susturganimizda, bu erkaklarning reproduktiv to'qimalarida fosfataza faolligining kuchli pasayishini aniqladik (3a-rasm) va EPP susturilgan erkaklar bilan juftlashgan urg'ochilar qisman gen susturulmasiga qaramay, defosforlangan 3D20E ning sezilarli darajada pastroq ulushini ko'rsatdilar (3b-rasm) (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2b-rasm, c). Aksincha, biz bir xil chivinlarda 20E22P/20E nisbatida sezilarli o'zgarishlarni aniqlamadik, bu ferment 3D20E22P uchun xos ekanligini ko'rsatishi mumkin (3b-rasm).
a, Ikki qatorli EPP RNK (dsEPP) yoki ikki qatorli GFP RNK (dsGFP) nazorati yordamida EPP susturulması natijasida MAGda fosfataza faolligining pasayishi. Har bir replikatsiyada yigirma MAG puli ishlatilgan (P = 0,0046, juft t-test, ikki tomonlama), alohida nuqtalar bilan ifodalangan. b, EPP susturulması bilan juftlashtirilgan urg'ochilarda 3 ot kuchida defosforlangan 3D20E ulushi sezilarli darajada past edi (P = 0,0043, juftlashtirilmagan t-test, ikki tomonlama), 20E darajalari esa ta'sirlanmagan (P = 0,063, juftlashtirilmagan). t-test, ikki tomonlama). Ma'lumotlar har biri 13, 16 va 19 urg'ochi bo'lgan uchta guruhdan o'rtacha ± sem sifatida taqdim etilgan.c, EPP bilan jim bo'lgan erkaklar bilan juftlashtirilgan urg'ochilarda qayta juftlashish darajasi sezilarli darajada yuqori edi (P = 0.0002, Fisherning aniq testi, ikki tomonlama). Urg'ochilar juftlashish holatini ta'minlash uchun avval juftlashishga majbur bo'lishdi; 2 kundan so'ng, ular transgen sperma tashuvchi boshqa erkaklar bilan bog'lanib, transgenni miqdoriy PCR orqali aniqlash orqali qayta juftlashish tezligini baholashdi. EPP bilan susaytirilgan erkaklar bilan juftlashtirilgan qon bilan oziqlangan urg'ochilarda tug'ilish sezilarli darajada pasaygan (P < 0.0001; Mann-Whitney testi, ikki tomonlama) va tuxum soni biroz kamaygan (P = 0.088, Mann-Whitney testi, ikki tomonlama), urug'lanish tezligi esa ta'sirlanmagan (P = 0.94, Fisherning aniq testi, ikki tomonlama). Barcha panellarda n biologik jihatdan mustaqil chivin namunalari sonini ifodalaydi. NS, ahamiyatli emas.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Keyin, biz ekdizon defosforillanishi urg'ochilarda juftlashishga qarshilikni qo'zg'atish uchun muhimligini baholadik. Shunisi e'tiborga loyiqki, EPP kamaygan erkaklar bilan juftlashgan urg'ochilar qo'shimcha (transgen) erkaklarga duchor bo'lganda, nazorat urg'ochilariga (10,4%) qaraganda ancha yuqori chastotada (44,9%) qayta juftlashgan (3c-rasm). Shuningdek, biz tug'ilishning sezilarli darajada pasayishini (3d-rasm, chapda) va bu urg'ochilar tomonidan qo'yilgan tuxumlar sonining biroz kamayishini (3d-rasm, o'rtada) kuzatdik, urg'ochilar tomonidan qo'yilgan tuxumlar foizi (urg'ochilarda juftlashish orqali paydo bo'lgan yana bir javob)) ta'sirlanmagan (3d-rasm, o'ngda). 3D20E22P uchun EPP ning kuzatilgan o'ziga xosligini hisobga olsak, bu natijalar juftlashish paytida uzatilgan EPP tomonidan 3D20E ning faollashishi urg'ochilarning keyingi juftlashishga retseptivligini o'chirishda muhim rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi, bu xatti-harakatlar ilgari 20E ning jinsiy o'tishi bilan bog'liq edi. Shuning uchun, bu erkakka xos gormon ayollarning tug'ilishiga ham kuchli ta'sir qiladi.
Keyin, biz kimyoviy sintezlangan 3D20E (4a-c-rasm) va tijoratda mavjud bo'lgan 20E dan foydalangan holda jinsiy yetuk bokira qizlarga in'ektsiya tajribalarida 20E va 3D20E faolligini taqqosladik. Biz 3D20E ikkala konsentratsiyada ham urg'ochilarning juftlashishga sezgirligini o'chirishda 20E ga qaraganda ancha samarali ekanligini kuzatdik (4d-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, LRTdagi 3D20E fiziologik darajasining yarmi (in'ektsiyadan keyin 1066 pg va juftlashishdan keyin 2022 pg) eng yuqori konsentratsiyada, ya'ni juftlashishdan keyin 18 pg da, in'ektsiyadan 24 soat o'tgach, 20E fiziologik darajasidan (in'ektsiyadan keyin 361 pg) 20 baravar yuqori bo'lgan refrakter urg'ochilarning ulushini keltirib chiqardi; Kengaytirilgan ma'lumotlar jadvali 1). Bu natija 20E ning jinsiy yo'l bilan o'tishi juftlashishning refrakter davrlarini keltirib chiqarmaydi degan fikrga mos keladi va 3D20E ni ota-ona va bola o'rtasidagi munosabatlarni ta'minlashda asosiy omil sifatida ko'rsatadi. 3D20E shuningdek, bokira urg'ochilarda tuxum qo'yish tahlillarida 20E ga qaraganda ancha faolroq edi (4e-rasm), bu qisman EPP sustlashgandan keyin kuzatilgan normal tuxum qo'yish tezligi juftlashish natijasida hosil bo'lgan urg'ochi omillar tomonidan hali ham ishlab chiqarilgan qoldiq 3D20E faolligining mavjudligi bilan bog'liqligini ko'rsatadi.
(a,b) 20E dan kimyoviy yo'l bilan sintezlangan 3D20E (a) juda yuqori konversiya/samaradorlik bilan (ma'lumotlar uchta mustaqil sintez reaksiyasidan olingan o'rtacha ± sem sifatida taqdim etilgan) (b).c, Massa spektri (pastki yarmi) juftlashgan urg'ochi LRT (yuqori yarmi) da topilgan ekdizonga to'liq mos keladi.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisherning aniq testi, ikki tomonlama) va 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisherning aniq testi, 2 tomonlama) bilan solishtirganda, 20E esa faqat yuqori dozalarda (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fisherning aniq testi, 2 tomonlama) nazorat guruhidan sezilarli darajada yuqori edi. 3D20E in'ektsiyasi bokira urg'ochilarda 10% etanolli nazorat guruhiga qaraganda ancha yuqori urug'lanish tezligini keltirib chiqardi (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fisherning aniq testi, ikki tomonlama), nazorat guruhiga nisbatan esa 20E faqat yuqori dozalarda (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fisherning aniq testi, ikki tomonlama). 3D20E yuqori dozalarda (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fisherning aniq testi, ikki tomonlama) 20E ga qaraganda ancha yuqori urug'lanish tezligini keltirib chiqardi. Barcha panellarda n biologik jihatdan mustaqil chivin namunalari sonini ifodalaydi. NS, ahamiyatli emas.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Ma'lumotlar uchta replikatsiyadan olingan.
Avvalgi tadqiqotlarda biz steroid gormonlarining jinsiy yo'l bilan o'tishi A. gambiae urg'ochilarini P. falciparum infektsiyasidan himoya qiluvchi ayol reproduktiv geni bo'lgan MISO (Oogenezning juftlashish bilan qo'zg'atilgan stimulyatori 11) ning ifodasini keltirib chiqarishini aniqladik. 13 tufayli kelib chiqadigan sog'liq uchun zararlar, bu eng xavfli inson bezgak parazitidir. MISO ning bezgak tarqalgan hududlarda Anophelesning reproduktiv salomatligi uchun ahamiyatini hisobga olgan holda, biz ushbu genning ifodasini qaysi 3D20E yoki 20E gormoni qo'zg'atishini aniqlashga qaror qildik. Biz 20E in'ektsiyasi HR3 va HR4 kabi ba'zi yadro gormoni retseptorlarini (HR) va Vg14, 15, 16 kabi odatiy quyi oqimdagi steroid nishonlarini maxsus yoki kuchliroq qo'zg'atgan bo'lsa-da, MISO 3D20E tomonidan kuchliroq qo'zg'atilganligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 3-rasm). Shunday qilib, ushbu androgenik steroid gormonining jinsiy yo'l bilan o'tishi ayollarni parazit infektsiyasi keltirib chiqaradigan xarajatlardan himoya qiluvchi mexanizmlarni qo'zg'atadiganga o'xshaydi. Bundan tashqari, 3D20E ikkala izoformga ham turlicha ta'sir qiladi. E retseptorlari EcR ning EcR ni qo'zg'atadigan va EcR-B ni bostiradigan, shuningdek, ayollarning tug'ilishiga ta'sir qiluvchi HPX15 kabi boshqa juftlashishni keltirib chiqaradigan genlarni kuchliroq qo'zg'atadigan. Bu EPP bilan jim bo'lgan erkaklar bilan juftlashgan ayollarda kuzatiladigan sezilarli bepushtlikni tushuntirishi mumkin (Kengaytirilgan ma'lumotlar 3-rasm). Bu ma'lumotlar jinsga xos funktsiyaning asosi bo'lishi mumkin bo'lgan ikkita ekdizon gormoni tomonidan afzalroq faollashtirilgan pastga yo'llarning mavjudligini ko'rsatadi.
Keyin, biz bioinformatika quvur liniyasida aniqlangan ikkita EcK genining funktsiyasini sinab ko'rdik. EcK1 yoki EcK2 ni susturish erkaklarda sezilarli darajada o'limga olib keldi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4a-rasm), bu ekdizon fosforillanishi va shuning uchun inaktivatsiya omon qolish uchun muhimligini ko'rsatadi. EcK2 EcK1 ga qaraganda yuqori darajada ifodalanganligi va proteomika tomonidan MAGlarda aniqlanganligi sababli (2b, c-rasm va 2-qo'shimcha jadval), biz uning ekdisteroid kinaz faolligini 20E bilan inkubatsiya qilish orqali tasdiqladik, bu esa 20E22P fosforillanishiga olib keldi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2-rasm).4b). 3D20E ni substrat sifatida ishlatganda, biz fosforillangan mahsulot 3D20E22P ni aniqlay olmadik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 4c-rasm), bu 3D20E o'rniga 20E EcK2 ning afzal ko'rgan nishoni bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Bizning RNK-seq tahlilimizga ko'ra, EcK2 bokira urg'ochilarning LRTsida ham yuqori darajada ifodalangan, u yerda juftlashgandan keyin o'chirilgan (2b-rasm). Biz bu ma'lumotlarni tasdiqladik va EcK2 ifodasiga qon bilan oziqlantirish ta'sir qilmaganligini aniqladik (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5a-rasm). Dastlabki MS tajribalarimizni kengaytirib, biz 20E22P cho'qqisi 20E cho'qqisi bilan chambarchas bog'liqligini aniqladik (qon bilan oziqlanganidan keyin 22-26 soat; Kengaytirilgan ma'lumotlar 5b-rasm). Bokira urg'ochilarda EcK2 ning sustlashishi qon bilan oziqlanganidan 26 soat o'tgach, 20E ning 20E22P ga nisbiy nisbatining 3 baravar oshishiga olib keldi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2c va 5c-rasmlar), bu EcK2 urg'ochilarda 20E ni fosforillashini ham tasdiqlaydi. Shunisi e'tiborga loyiqki, EcK2 kamaygan bokiralar to'liq jinsiy qabul qilishni saqlab qolishdi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5d,e-rasm), bu esa urg'ochilarda 20E ishlab chiqarish juftlashishni keltirib chiqarmasligini yana bir bor ko'rsatadi. refrakter davrlar. Biroq, bu urg'ochilar nazorat guruhiga nisbatan tuxum qo'yish darajasini sezilarli darajada oshirgan, bokiralarning 30% dan ortig'i tuxum qo'ygan (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5f-rasm). Agar qon bilan oziqlangandan keyin ikki qatorli Eck2 RNK (dsEcK2) in'ektsiyalari amalga oshirilsa, urug'lanish sodir bo'lmadi, bu vaqtda qonni yutish natijasida 20E cho'qqisi pasaygan. Umuman olganda, bu natijalar qon so'rishdan keyin hosil bo'lgan 20E urug'lanishni keltirib chiqarishi mumkin bo'lgan modelni qo'llab-quvvatlaydi, ammo faqat urug'lanish bloki (EcK2 va ehtimol boshqa omillar) juftlashish orqali o'chirilganda. Na 20E, na 3D20E in'ektsiyalari bokiralarda EcK2 ifodasini inhibe qilmadi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5g-rasm), bu boshqa omillar bu kinazning inhibatsiyasini vositachilik qilishini ko'rsatadi. Biroq, qon bilan oziqlangandan keyin 20E darajasi juftlashish noqulayligini keltirib chiqarish uchun etarli emas edi, lekin jinsiy yo'l bilan o'tadigan 3D20E ning yuqori titrlari bilan samarali ravishda qo'zg'atildi.
Bizning natijalarimiz A. gambiae ning reproduktiv muvaffaqiyatini tartibga soluvchi mexanizmlar haqida muhim tushunchalar beradi. Erkaklar 3D20E ning yuqori titrlarini sintez qilish uchun evolyutsiyalashgan model paydo bo'ldi, bu erkaklarga xos modifikatsiyalangan ekdizon bo'lib, urg'ochilarni keyingi juftlashishga sezgirligini yo'qotish orqali ota-onalikni ta'minlaydi. Shu bilan birga, bu bezgak vektorlari erkaklarga xos EPP ning jinsiy o'tishiga javoban urg'ochilarda 3D20E ni faollashtirish uchun samarali tizimni ham ishlab chiqdilar. Bizning ma'lumotimizga ko'ra, bu hasharotlarda noyob va muhim funktsiyani bajaradigan erkak va urg'ochi hukmronlik qiladigan steroid gormon tizimining birinchi misolidir. Erkaklarga xos ekdizon funktsiyasi taxmin qilingan, ammo aniq ko'rsatilmagan. Masalan, asosan rad etilgan gipoteza 18 bu funktsiyalarni 20E prekursori E1 tomonidan bajarilishi mumkinligidir. Drosophilada monandriya ayol reproduktiv traktini ma'lum jinsiy peptid retseptorlari orqali innervatsiya qiluvchi neyronlar bilan o'zaro ta'sir qiluvchi kichik jinsiy peptidlarning19,20 jinsiy o'tishi bilan qo'zg'atilishi ma'lum21,22. Aniqlash uchun qo'shimcha ishlar talab etiladi. A. gambiae urg'ochilarida 3D20E tomonidan boshqariladigan pastga yo'naltirilgan signalizatsiya kaskadlari va bu kaskadlarning chivinlar va Drosophila o'rtasida saqlanishi mumkinligini aniqlash.
Bizning tadqiqotimizda aniqlangan ayollarning tug'ilishi va xulq-atvoriga 3D20E ning muhim rolini hisobga olgan holda, 3D20E sintezi va faollashuviga olib boradigan yo'llar kelajakdagi chivinlarni nazorat qilish strategiyalari uchun yangi imkoniyatlarni taqdim etadi, masalan, steril hasharotlar texnologiyasi strategiyalarida raqobatbardosh steril erkaklarni yaratish. Yovvoyi holda qo'yib yuborish yoki bokiralik o'yinida 3D20E ni taqlid qilish uchun foydalaning. 3D20E ning erkaklarga xos funktsiyasi A. gambiae va boshqa Cellia turlari o'z spermalarini juftlashish tiqinlariga koagulyatsiya qilish qobiliyatiga ega bo'lganida rivojlangan bo'lishi mumkin, chunki bu ko'p miqdordagi gormonlar va gormonlarni faollashtiruvchi fermentlarni samarali o'tkazish imkonini beradi. O'z navbatida, monandriyani amalga oshiradigan 3D20E evolyutsiyasi urg'ochilarga (MISO ning yuqori ifodasi orqali) bezgak tarqalishi yuqori bo'lgan hududlarda reproduktiv salohiyatini qo'llab-quvvatlash mexanizmini taqdim etadi, bu esa bilvosita Plazmodium yuqishiga hissa qo'shadi. Urg'ochi 20E urg'ochi Anopheles chivinlarida P. falciparumning omon qolishi va o'sishiga chuqur ta'sir ko'rsatishi isbotlanganligini hisobga olsak,24 erkak va urg'ochi steroid gormon yo'llari endi chivin-parazit o'zaro ta'sirining asosiy jihatlari hisoblanadi.
A. gambiae G3 shtammlari standart hasharotlar sharoitida (26-28 °C, 65-80% nisbiy namlik, 12:12 soat yorug'lik/qorong'u fotoperiod) o'stirildi. Lichinkalar baliq kukuni bilan oziqlantirildi (TetraMin Tropical Flakes, Koi granulalari va Tetra Pond Sticks 7:7:2 nisbatda). Voyaga yetgan chivinlarga ad libitum 10% dekstroza eritmasi va haftalik inson qoni berildi (qon tarkibiy qismlarini o'rganish). Bokira chivinlar mikroskopiya yordamida uchlarini tekshirgandan so'ng, qo'g'irchoq bosqichida jinslarni ajratish orqali olindi. DsRed transgenini olib yuruvchi erkaklar ilgari tasvirlangan.
Majburiy juftlashtirish tajribalari avval tasvirlangan protokollarga muvofiq o'tkazildi. Tabiiy juftlashtirish uchun 4 kunlik bokira urg'ochilar ikki kecha davomida jinsiy yetuk bokira erkaklar bilan 1:3 nisbatda saqlandi. Erkaklarga dsEPP yuborilgan tajribalar uchun birgalikda qafaslash in'ektsiyadan keyingi 3-4-kunlarga to'g'ri keldi, bu vaqtda fosfataza faolligi maksimal darajada pasaygan (Kengaytirilgan ma'lumotlar 2b-rasm).
Chivin to'qimalari, qolgan jasadlar (tananing qolgan qismi) yoki butun tana 100% metanolga bo'linib, munchoq bilan gomogenlashtirildi (2 mm shisha munchoqlar, 2400 rpm, 90 sek). To'qimalar miqdori va metanol hajmi quyidagicha edi: tananing qolgan qismi, 1000 µl da 50; MAG, 50–100 80 µl; urg'ochi LRT, 25–50 80 µl. Cho'kma bir xil hajmdagi metanol bilan ikkinchi metanol ekstraktsiyasiga uchratildi. Hujayra qoldiqlari santrifugalash orqali olib tashlandi. Ikkala ekstraktsiyadan olingan metanol birlashtirildi va azot oqimi ostida quritildi, so'ngra suvda 80% metanolning quyidagi hajmlarida qayta suspenziya qilindi: tananing qolgan qismi, 50 µl; MAGlar va urg'ochi LRT, 30 µl.
Namunalar LC asbobiga (Vanquish, Thermo Fisher) ulangan massa spektrometrida (ID-X, Thermo Fisher) tahlil qilindi. 25 °C da saqlangan 3 µm, 100 × 4,6 mm ustunga (Inspire C8, Dikma) 5 µl namuna yuborildi. LC uchun harakatlanuvchi fazalar A (suv, 0,1% chumoli kislotasi) va B (asetonitril, 0,1% chumoli kislotasi) edi. LC gradienti quyidagicha edi: 1 daqiqa davomida 5% B, keyin 11 daqiqa davomida 100% B gacha oshirildi. 100% da 8 daqiqadan so'ng ustunni 5% B da 4 daqiqa davomida qayta muvozanatlashtiring. Oqim tezligi 0,3 ml min-1 ni tashkil etdi. MS manbaida ionlanish musbat va manfiy rejimlarda qizdirilgan elektropurkagich ionlanishi orqali amalga oshiriladi.
Mass-spektrometr m/z diapazonidagi ma'lumotlarni to'liq MS rejimida 60 000 piksellar sonida 350 dan 680 gacha o'lchaydi. MS/MS ma'lumotlari [M + H]+ (barcha nishonlar), [M - H2O + H]+ (barcha nishonlar) va [M - H]- (fosforlangan nishonlar) bo'yicha olindi. MS/MS ma'lumotlari standart mavjud bo'lmagan nishonlarning ekdizon xususiyatlarini tasdiqlash uchun ishlatilgan. Maqsadli bo'lmagan ekdisteroidlarni aniqlash uchun nisbiy ko'pligi >15% bo'lgan barcha HPLC cho'qqilari uchun MS/MS ma'lumotlari tahlil qilindi. Bitta aniq namunaning (boshqa barcha nishonlar) mutlaq miqdorlarini yoki suyultirishlarini hisoblash uchun ularning bitta erkakda topilgan miqdorlarga ekvivalentligini hisoblash uchun sof standartlardan (20E, 3D20E) yaratilgan standart egri chiziqlar yordamida miqdorini aniqlang. 3D20E uchun quyidagi qo'shimchalarning yig'indisi yordamida miqdorini aniqlash amalga oshirildi: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Ma'lumotlar Tracefinder (4.1-versiya) yordamida ajratib olindi va miqdori aniqlandi. MS/MS ma'lumotlari Xcalibur (4.4-versiya) yordamida tahlil qilindi. E, 20E va 3D20E ning MS spektrlari tegishli standartlar bilan taqqoslandi. 3D20E22P Girard reagenti bilan hosil qilish orqali tahlil qilindi. 20E22P m/z nisbati bilan tahlil qilindi.
3D20E22P MAG dan tozalandi. Tozalash HPLC-MS/MS tahlili bilan bir xil LC sharoitida kvadrupol massaga asoslangan detektor (QDa, Acquity, Waters) bilan ultra samarali suyuqlik xromatografi (Acquity, Waters) yordamida analitik shkala bo'yicha amalga oshirildi. 3D20E22P ga mos keladigan m/z avval aniqlanganidek bir xil saqlash vaqtida aniqlanganda fraksiya yig'ish ishga tushirildi. Keyin ajratib olingan birikmalarning sofligi yuqorida tavsiflanganidek HPLC-MS/MS yordamida tekshirildi.
Umumiy RNK 10-12 ta reproduktiv to'qimalardan yoki tananing boshqa qismlaridan (boshsiz) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq TRI reaktivi (Thermo Fisher) yordamida ajratib olindi. RNK TURBO DNase (Thermo Fisher) bilan ishlov berildi. cDNK ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Moloney sichqoncha leykemiyasi virusining teskari transkriptazasi (M-MLV RT; Thermo Fisher) yordamida sintez qilindi. Teskari transkripsiya miqdoriy PCR (RT-qPCR; Kengaytirilgan ma'lumotlar jadvali 2) uchun primerlar ilgari nashr etilgan24 yoki Primer-BLAST26 yordamida ishlab chiqilgan bo'lib, o'lchami 70-150 bp bo'lgan va ekzon-ekzon birikmalarini qamrab oluvchi mahsulotlarga yoki Primer juft primerlariga alohida ekzonlarga ustunlik berilgan. Uchdan to'rttagacha biologik replikatsiyalardan olingan cDNK namunalari RT-qPCR uchun suvda to'rt marta suyultirildi. Miqdorlash 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerlar va 5 µl suyultirilgan kDNKni o'z ichiga olgan 15 µl replikatsiya reaksiyalarida amalga oshirildi. Reaksiyalar ... da o'tkazildi. QuantStudio 6 Pro real vaqt rejimidagi PCR tizimi (Thermo Fisher) va ma'lumotlar Dizayn va tahlil (2.4.3 versiyasi) yordamida to'plandi va tahlil qilindi. Ushbu tadqiqotda ko'rsatilgandek, nisbiy miqdorlar qon bilan oziqlantirish 27 yoki juftlashish 3 bilan sezilarli darajada o'zgarmagan ribosomal gen RpL19 (AGAP004422) ga normallashtirildi.
RNK sifati Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) yordamida tekshirildi. Illumina juftlashgan kutubxonalari MIT va Garvardning Broad institutida tayyorlandi va ishga tushirildi. Ketma-ketlik o'qishlari standart parametrlar bilan HISAT2 (2.0.5 versiyasi) yordamida A. gambiae genomiga (PEST shtammi, 4.12 versiyasi) moslashtirildi. Xaritalash sifati (MAPQ) ballari <30 bo'lgan o'qishlar Samtools (1.3.1 versiyasi) yordamida olib tashlandi. Genlarga xaritalangan o'qishlar soni standart parametrlar bilan htseq-count (0.9.1 versiyasi) yordamida hisoblandi. Normallashtirilgan o'qishlar soni hisoblandi va R (4.0.3 versiyasi) da DESeq2 paketi (1.28.1 versiyasi) yordamida differentsial gen ekspressiyasi tahlil qilindi.
Ekdizonni modifikatsiyalovchi gen nomzodlari avval A. gambiae genomini PSI-BLAST algoritmi (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) yordamida qidirish orqali aniqlandi, bunda quyidagi so'rov oqsili ketma-ketliklariga ega standart parametrlar qo'llanildi: Bombyx mori (Kirish raqami NP_001038956.1), Musca domestica (Kirish raqami XP_005182020.1, XP_005175332.1 va XP_011294434.1) va Microplitis demolitor (Kirish raqami XP_008552646.1 va XP_008552645.1) dan EcK, B. mori (Kirish raqami NP_001036900), Drosophila melanogaster (Kirish raqami NP_651202) dan, Apis mellifera (Kirish raqami XP_394838) va Acyrthosiphon pisum (Kirish raqami XP_001947166); va B. mori dan EPP (Kirish raqami XP_001947166) NP_001177919.1 va NP_001243996.1) va D. melanogaster ning EO (Kirish raqami NP_572986.1) (1-qadam). Keyin, Gambiyadagi reproduktiv to'qimalarda (ayol LRT yoki MAG) yuqori mRNA ifodasiga (million xaritalangan o'qishga >100 fragment/kilobaza eksonlari (FPKM) yoki >85%) asoslangan filtrlash natijalari (2-qadam). Spesifiklikni oshirish uchun biz juftlashish paytida ekdizonni sintez qilmaydigan yoki uzatmaydigan anopheles turi bo'lgan A. albimanusning reproduktiv to'qimasida ham ifodalanadigan nomzod fermentlarni tanladik. Nomzod genlar A. albimanus reproduktiv to'qimasida past ifodaga (<100 FPKM yoki <85-persentil) asoslanib filtrlangan (3-bosqich). Yakuniy filtr sifatida (4-bosqich) nomzod genlar quyidagilardan kamida bittasini qondirishi kerak: (1) differentsial ifodalangan genlar tahliliga ko'ra juftlashishdan keyin sezilarli darajada yuqori regulyatsiya (P <0,05) va (2) reproduktiv bo'lmagan to'qimalarda (<85% yoki <100 FPKM).
Biz butun organizmni izotopik yorliqlashga erishish uchun avval tasvirlangan 28,29,30 usullarni o'zgartirdik. Qisqacha aytganda, yovvoyi turdagi Saccharomyces cerevisiae II turi (YSC2, Sigma) azotning yagona manbai sifatida (og'irlik/vol) 2% glyukoza (G7528, Sigma), 1,7% aminokislotasiz va ammoniy sulfat. madaniy muhit) va 5% 15N ammoniy sulfat (NLM-713, >99%, Kembrij Izotop Laboratoriyalari) bo'lgan xamirturush azot bazasida (BD Difco, DF0335) sinovdan o'tkazildi. Xamirturush santrifugalash orqali ajratib olindi va chivin lichinkalari qo'g'irchoqqa aylanguncha erkin berildi. To'rtinchi yoshdagi o'limning oldini olish uchun baliq uni bilan qo'shimcha (300 lichinkaga 0,5 mg). Keyin juftlashish paytida uzatilgan erkak proteomni tahlil qilish uchun yorliqsiz erkaklar bilan juftlashish tajribalarida faqat urg'ochi hayvonlar ishlatilgan.
4-6 kunlik 15N-yorliqli bokira urg'ochilar yoshga mos keladigan, belgilanmagan bokira erkaklar bilan juftlashishga majbur bo'ldi. Muvaffaqiyatli juftlashish epifloresans mikroskopiyasi ostida juftlashish vilkalarini aniqlash orqali tasdiqlandi. 3, 12 va 24 ot kuchida 45-55 juftlashgan urg'ochilarning atriyalari 50 µl ammoniy bikarbonat buferiga (pH 7.8) ajratildi va pestle bilan gomogenlashtirildi. Gomogenat santrifugaga solindi va supernatant 50 mM ammoniy bikarbonatdagi 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) bilan aralashtirildi. Har bir namunadan olingan supernatant va granula quruq muzda muzlatildi va bir kechada Vashington universitetidagi MacCoss laboratoriyasiga jo'natildi, u yerda LC-MS/MS uchun namunalarni tayyorlash yakunlandi. Granulani 50 mM ammoniydagi 50 µl 0.1% RapiGestda qayta eriting. Suv hammomida bikarbonat va sonikat. Pellet va supernatantning oqsil konsentratsiyasi BCA tahlili yordamida o'lchandi, namunalar 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma) bilan kamaytirildi, 15 mM yodoatsetamid (Sigma) bilan alkillandi va 37 °C da (1:0 50) 1 soat davomida tripsinizatsiya: tripsin: substrat nisbati bilan inkubatsiya qilindi. RapiGest 200 mM HCl qo'shilishi bilan lizis qilindi, so'ngra 37 °C da 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va qoldiqlarni olib tashlash uchun 4 °C da 10 daqiqa davomida 14000 rpm da santrifüj qilindi. Namunalar ikki rejimli qattiq fazali ekstraksiya (Oasis MCX kartridjlari, Waters) bilan yuvildi va 0,1% chumoli kislotasida 0,33 µg µl-1 oqsil konsentratsiyasi uchun qayta suspenziya qilindi. Yorliqsiz MAG proteomlari ham xuddi shunday bokiralikdan tahlil qilindi. erkaklar. Har bir namuna uchun ikkita analitik replika tahlil qilindi. Keyin, har birining 1 µg miqdori 25 sm eritilgan kremniy 75 μm ustun, Jupiter C12 teskari fazali qatron (Phenomenex) bilan to'ldirilgan 4 sm eritilgan kremniy Kasil1 (PQ) frit tuzog'i va 180 daqiqalik suyuq xromatografiya yordamida tahlil qilindi. Namuna dayjestlari – MS/MS Q-Exactive HF mass-spektrometrida (Thermo Fisher) nanoACQUITY UPLC tizimi (Waters) yordamida ishga tushirildi. Har bir ishga tushirish uchun yaratilgan ma'lumotlarga bog'liq yig'ish ma'lumotlari Proteowizard (3.0.20287 versiyasi) va Comet31 (3.2 versiyasi) yordamida Anopheles gambiae (VectorBase versiyasi 54), Anopheles coluzzi oqsil ketma-ketliklarini o'z ichiga olgan FASTA ma'lumotlar bazasiga qarshi mzML formatiga o'zgartirildi. Mali-NIH (VectorBase versiyasi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021 yil mart), A. gambiae RNK-seq va ma'lum inson ifloslantiruvchi moddalarining uch kadrli tarjimalarida qidiruv o'tkazildi. Peptid xaritasi bilan moslashtirilgan FDRlar Percolator32 (3.05 versiyasi) yordamida 0.01 chegarasi bilan aniqlandi va peptidlar Limelight33 da oqsil parsimoniyasi yordamida oqsil identifikatsiyalariga yig'ildi. (2.2.0 versiyasi). Nisbiy oqsil miqdori avval tasvirlanganidek, har bir yugurishdagi har bir oqsil uchun hisoblangan normallashtirilgan spektral ko'plik koeffitsienti (NSAF) yordamida baholandi. Har bir oqsilga nisbatan NSAF ikki xil biologik replikadan olingan namunalar bo'yicha o'rtacha hisoblandi. 15N yorliqlash urg'ochi proteomni muvaffaqiyatli niqobladi, garchi yorliqlangan bokiralardan oz miqdordagi yorliqlanmagan oqsil aniqlanishi mumkin bo'lsa ham. Biz urg'ochi xom namunalarda erkak oqsilining kamayishi (1-5 spektr) faqat texnik yugurishlarda aniqlanganini qayd etdik, bu yerda xom namunalar erkak/juftlashuvchi namunalardan keyin HPLC "o'tkazilishi" natijasida o'tkazildi. Yorliqlangan bokiralardan "ifloslantiruvchi" sifatida topilgan vaqti-vaqti bilan oqsillar 1-qo'shimcha jadvalda keltirilgan.
Genscriptda ikkita antigenik peptid, QTTDRVAPAPDQQQ (PA izotipi ichida) va MESDGTTPSGDSEQ (PA va PB izotipi ichida). Ikkala peptid birlashtirildi, keyin KLH tashuvchi oqsiliga konjugatsiya qilindi va Yangi Zelandiya quyonlariga yuborildi. To'rtinchi in'ektsiyadan keyin quyonlar so'yildi va umumiy IgG affinlik tozalash orqali ajratib olindi. Eng EPPga xos quyondan olingan IgG keyingi g'arbiy blotting uchun ishlatilgan.
Western blots uchun MAG (n = 10, bu yerda n biologik jihatdan mustaqil chivin namunalari sonini ifodalaydi) va 4 kunlik bokira erkaklar va bokira yoki majburiy juftlashgan urg'ochi hayvonlardan (<10 juftlashgandan keyin) olingan urg'ochi LRT (n = 30) alohida qo'shildi. Oqsil ekstraksiya buferi (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natriy deoksixolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × proteaza inhibitori kokteyli (Roche)) alohida qo'shildi. Namunalar dissektsiyadan so'ng darhol boncuk (2 mm shisha boncuklar, 2400 rpm, 90 sek) bilan gomogenlashtirildi. Erimaydigan qoldiqlar 20 000 g da 4 °C da santrifugalash orqali olib tashlandi. Oqsillar Bradford tahlili (Bio-Rad) yordamida aniqlandi. Keyin 20 µg MAG oqsili, 40 µg LRT oqsili va 20 µg Qoldiq oqsil miqdori denatüre qilindi va MOPS buferi yordamida 10% Bis-Tris NuPAGE bilan ajratildi. Oqsillar iBlot2 uzatish tizimi (Thermo Fisher) yordamida poliviniliden ftorid membranalariga o'tkazildi. Membranalar 1× PBS-T da ikki marta yuvildi (PBS da 0,1% Tween-20) va keyin Odyssey blokirovka buferida (Li-Cor) 22°C da 1 soat davomida bloklandi. Membranalar 4°C da maxsus quyon anti-EPP poliklonal birlamchi antitelo (blokirovka buferida 1:700) va kalamush anti-aktin monoklonal birlamchi antitelo MAC237 (Abeam; 1:4000) bilan bir kechada chayqatildi. Membranalar PBS-T bilan yuvildi va keyin 0,01% SDS va ni o'z ichiga olgan blokirovka buferida ikkilamchi antitelolar (eshak anti-quyon 800CW va echki anti-kalamush 680LT (Li-Cor), ikkalasi ham 1:20000) bilan inkubatsiya qilindi. 22 °C da 1 soat davomida 0,2% Tween -20 eritmasi bilan yuvildi. Membranalar PBS-T bilan yuvildi va Odyssey CLx skaneri yordamida tasvirga olindi. Tasvirlar Image Studio (5.2 versiyasi) da to'plandi va qayta ishlandi. EPP-RA izoformasiga (82 kDa) mos keladigan ma'lum bir tasma aniqlanmadi.
EPP (gistidin fosfataza domenini o'z ichiga olgan AGAP002463-RB izoformi sifatida, NCBI saqlangan domen qidiruvi 34) va EcK2 (AGAP002181) ning kodlash mintaqalari pET-21a(+) plazmidiga (Novagen Millipore Sigma) klonlandi; primerlar Kengaytirilgan Ma'lumotlar Jadvalining 2-qismida keltirilgan. PET-21a(+)-EcK2 konstruktsiyasining C-terminal 6xHis yorlig'idan oldin sakkizta GS4 bog'lovchisi (tandemda) kiritildi. Rekombinant oqsillar NEBExpress hujayrasiz E. coli oqsil sintezi reaksiyasi (New England BioLabs) yordamida ishlab chiqarildi. Rekombinant oqsillar NEBExpress Ni spin ustunlari (New England BioLabs) yordamida tozalandi. Digidrofolat reduktaza (DHFR) nazorat oqsili NEBExpress hujayrasiz E. coli oqsil sintezi to'plamidan DNK shabloni yordamida ishlab chiqarildi. Oqsillar PBSda 50% glitserinda -20 °C da 3 oygacha saqlandi.
EPP va to'qima ekstraktlarining fosfataza faolligi 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich) yordamida o'lchandi. Reaksiya buferida 25 mM Tris, 50 mM sirka kislotasi, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA va 1 mM DTT mavjud edi. To'qima reaksiya buferida gomogenlashtirildi va hujayra qoldiqlari santrifugalash orqali olib tashlandi. 2,5 mg ml-1 pNPP o'z ichiga olgan reaksiya buferiga ferment yoki to'qima ekstrakti qo'shib, reaksiyani boshlang. Reaksiya aralashmasi xona haroratida qorong'ida inkubatsiya qilindi va pNPP dan aylantirilgan pNP miqdori turli vaqtlarda 405 nm da absorbsiyani o'lchash orqali aniqlandi.
In vitro EcK faolligi uchun oqsil 200 µl buferda (pH 7.5) 0.2 mg 20E yoki 3D20E bilan 27 °C da 2 soat davomida 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP va 10 mM MgCl2 ni o'z ichiga olgan 200 µl buferda (pH 7.5) inkubatsiya qilindi. Reaksiya 800 µl metanol qo'shib to'xtatildi, so'ngra -20 °C da 1 soat davomida sovutildi, so'ngra 20 000 g da 4 °C da 10 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Keyin supernatant HPLC-MS/MS yordamida tahlil qilindi. Nazorat guruhida ishlatilgan oqsillarni issiqlik bilan inaktivatsiya qilish uchun oqsillar PBS da 50% glitserinda 95 °C da 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.
In vitro EPP faolligi uchun oqsil 25 mM Tris, 50 mM sirka kislotasi, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA va 1 mM DTT o'z ichiga olgan 100 µl buferda (pH 7.5) 3D20E22P (18 juft MAGda topilgan miqdorga teng) bilan 27 °C da 3 soat davomida inkubatsiya qilindi. Reaksiya 400 µl metanol qo'shib to'xtatildi va -20 °C da 1 soat davomida sovutildi, so'ngra 20 000 g da 4 °C da 10 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Supernatant HPLC-MS/MS yordamida tahlil qilindi.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) va EcK2 (556 bp) uchun PZR fragmentlari aralash jinsdagi boshsiz chivin jasadlaridan tayyorlangan kDNKdan kuchaytirildi. eGFP nazoratining (495 bp) PZR fragmenti avval tasvirlangan pCR2.1-eGFPdan kuchaytirildi; PCR primerlari Kengaytirilgan Ma'lumotlar Jadvali 2da keltirilgan. PCR fragmenti pL4440 plazmididagi teskari T7 promotorlari orasiga kiritildi. Plazmid konstruksiyalari NEB 5-α vakolatli E. coli (New England Biolabs) dan olindi va ishlatishdan oldin DNK ketma-ketligi bilan tasdiqlandi (qo'shimcha ma'lumotlar ketma-ketligi uchun 1-qo'shimcha ma'lumotlarga qarang). T7 promotoriga mos keladigan primerlar (Kengaytirilgan ma'lumotlar jadvali 2) pL4440 asosidagi plazmiddan qo'shimchani kuchaytirish uchun ishlatilgan. PCR mahsulotining o'lchami agaroza gel elektroforezi bilan tasdiqlangan. dsRNK Megascript T7 Transkripsiya Kit (Thermo Fisher) yordamida PCR shablonlaridan transkripsiya qilindi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq avval tasvirlangan modifikatsiyalar bilan tozalandi.
dsRNA in'ektsiyasi uchun ekloziyadan keyin 1 kun ichida kattalar erkaklari yoki urg'ochilarining (Nanoject III, Drummond) ko'krak qafasiga 10 ng nl-1 konsentratsiyasida 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) yuborildi. Genlarning nokdaun darajasi kamida uchta biologik replikatsiyada RNK ekstraksiya, kDNK sintezi va RT-qPCR orqali aniqlandi. Ekdizon in'ektsiyasi uchun 4 kunlik bokira yoki 6 kunlik bokira qon bilan oziqlangan urg'ochilarga eksperimental dizaynga qarab mos ravishda 1,3, 2,1 konsentratsiyalarda 0,13, 0,21 yoki 0,63 µg 20E yoki 3D20E (Nanoject III, Drummond) yoki 6,3 ng nl-1 yuborildi. 10% dan 100 nl (vol/vol) yuboring. suvdagi etanol; 10% etanoldagi 100 nl 3D20E22P (bir juft MAG tarkibidagi miqdorning 75% ga teng). Chivinlar tasodifiy ravishda in'ektsiya guruhiga tayinlandi.
Urug'lanish tahlillari uchun 3 kunlik urg'ochi chivinlar inson qoni bilan erkin oziqlantirildi. Qisman oziqlangan yoki oziqlanmagan chivinlar olib tashlandi. Davolashga qarab, urg'ochi chivinlar qon bilan oziqlanganidan keyin kamida 48 soat davomida to'rt kecha davomida alohida urchitish stakanlariga joylashtirildi. Tuxumlar stereoskop (Stemi 508, Zeiss) ostida sanaldi; juftlashgan urg'ochi chivinlar uchun lichinkalarga aylangan tuxumlar unumdor deb hisoblandi.
Juftlashtirish sinovlari uchun urg'ochilarga juftlashishga qarshilik ko'rsatish uchun davolash usuliga qarab kamida 2 kun vaqt berildi va yovvoyi turdagi yoshga mos keladigan erkaklar keyinchalik o'sha qafasga kiritildi. Ikki kechadan so'ng, urg'ochi urug'lantirilgan pufakchalar ajratildi va 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA va 25 mM NaCl (pH 8.2) o'z ichiga olgan buferda muzlatish-eritish va sonikatsiya orqali genomik DNK chiqarildi. Namunalar Proteinaza K (0.86 µg µl-1) bilan 55 °C da 15 daqiqa davomida, so'ngra 95 °C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Xom genomik DNK preparatlari 10 baravar suyultirildi va Y xromosoma ketma-ketliklarini qPCR aniqlashga duchor qilindi; primerlar kengaytirilgan ma'lumotlar jadvali 2da keltirilgan. Y xromosoma ketma-ketligining yo'qligi juftlashish yo'qligini ko'rsatadi.
Qayta juftlashish tahlillari uchun majburiy juftlashgan urg'ochilar juftlashish holatini tasdiqlash uchun juftlashish vilkalari bor-yo'qligini tekshirdi va ilgari tasvirlanganidek, erkaklar yo'qligida juftlashishga chidamlilik paydo bo'lishi uchun 2 kun vaqt berildi 36. Keyin DsRed transgen spermasini olib yuruvchi erkaklar urg'ochi qafaslarga kiritildi. Ikki kechadan so'ng, urg'ochilardan urug'lantiruvchi pufakchalar ajratildi va genom DNKsi yuqorida tavsiflanganidek tayyorlandi va DsRed transgenini qPCR aniqlashga duchor qilindi; primerlar kengaytirilgan ma'lumotlar jadvali 2da keltirilgan. DsRed transgenining yo'qligi qayta juftlashish sodir bo'lmaganligini ko'rsatdi.
3D20E avval tasvirlanganidek sintez qilindi 37. Qisqacha aytganda, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml suvda eritildi, so'ngra 30 mg platina qora (kukun shaklida, Sigma-Aldrich) qo'shildi. Reaksiya aralashmasiga O2 ning yumshoq oqimi doimiy ravishda pufakchalar bilan quyildi, u xona haroratida aralashtirildi. 6 soatdan so'ng, reaksiyani to'xtatish uchun 30 ml metanol qo'shildi. Aralashma katalizator zarralarini olib tashlash uchun santrifugaga solindi. Supernatant xona haroratida vakuumda quruqlikka bug'lantirildi. Quritilgan reaksiya mahsuloti HPLC-MS/MS tahlili uchun in'ektsiya uchun 10% etanol va metanolda eritildi. Konversiya darajasi (20E dan 3D20E gacha) taxminan 97% ni tashkil etdi (4b-rasm) va sintezlangan 3D20E ning MS spektri juftlashgan urg'ochilarda topilgan spektrga mos keldi (4c-rasm).
Afsonada o'tkazilgan statistik testlarning aniq tafsilotlari mavjud. Fisherning aniq testi, Mantel-Cox testi va Studentning t-testi uchun GraphPad (9.0 versiyasi) ishlatilgan. Cochran-Mantel-Haenszel testlari maxsus R skripti yordamida o'tkazildi (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test manzilida mavjud). Ma'lumotlar taqsimoti Shapiro-Wilk testi yordamida 0,05 ahamiyatlilik chegarasi bilan normallik uchun sinovdan o'tkazildi. Ma'lumotlar normallik testidan o'ta olmaganida, Mann-Whitney testi o'tkazildi. Omon qolish ma'lumotlari Mantel-Cox testi yordamida tahlil qilindi. DESeq2 paketi (1.28.1 versiyasi) RNK-seq gen darajasidagi differentsial ifoda tahlilini o'tkazish uchun ishlatilgan. Grafikdagi gorizontal chiziq medianani ifodalaydi. Barcha testlar uchun chegara sifatida P = 0,05 ahamiyatlilik qiymati ishlatilgan.
Tadqiqot dizayni haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun ushbu maqolaga havola qilingan Nature Research Report referatiga qarang.
MS proteomik ma'lumotlari PXD032157 ma'lumotlar to'plami identifikatori bilan PRIDE hamkor ombori (https://www.ebi.ac.uk/pride/) orqali ProteomeXchange konsorsiumiga (http://proteomecentral.proteomexchange.org) kiritildi.
RNK-seq ma'lumotlar to'plami Gen ekspressiyasi keng qamrovli kutubxonasida (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 seriya yozuvi ostida saqlanadi.
Joriy tadqiqot davomida yaratilgan va/yoki tahlil qilingan qo'shimcha ma'lumotlar to'plamlari tegishli mualliflardan oqilona so'rov bo'yicha olinishi mumkin. Ushbu maqolada manba ma'lumotlari keltirilgan.
De Loof, A. Ekdisteroidlar: E'tiborsiz qoldirilgan hasharotlar jinsiy steroidlari? Erkak: Qora quti. Hasharotlar fanlari.13, 325–338 (2006).
Redfern, Anopheles stephensda CPF 20-gidroksiekdizon va tuxumdon rivojlanishi. J. Hasharotlar fiziologiyasi.28, 97–109 (1982).