Sekretor yo'lda oqsillarni saralash hujayra bo'linishi va gomeostazni saqlab qolish uchun juda muhimdir. Qobiq vositachiligida saralashdan tashqari, sekretor transport jarayonida kinesinlarni saralashdagi lipidlarning roli uzoq vaqtdan beri javob topilmagan asosiy savoldir. Bu yerda biz juda uzun keramid lipid qismlariga ega yangi sintezlangan glikosilfosfatidilinozitol-immobilizatsiyalangan oqsillar klasterlanganligini va transmembran oqsillari tomonidan ishlatiladiganidan farq qiladigan ixtisoslashgan endoplazmalarning aniq chiqish joyiga tasniflanganligini in vivo isbotlash uchun 3D bir vaqtning o'zida ko'p rangli yuqori aniqlikdagi real vaqt rejimida tasvirlashni amalga oshiramiz. Bundan tashqari, biz endoplazmatik retikulum membranasidagi keramidning zanjir uzunligi bu saralash selektivligi uchun juda muhimligini ko'rsatamiz. Bizning tadqiqotimiz oqsil yuklarini lipid zanjiri uzunligiga asoslangan holda sekretor yo'lda selektiv eksport joylariga tasniflash uchun birinchi to'g'ridan-to'g'ri in vivo dalillarni taqdim etadi.
Eukaryotik hujayralarda endoplazmatik retikulumda (ER) sintezlangan oqsillar keyinchalik tegishli hujayra manziliga yetkazib berish uchun sekretor yo'l orqali tashish paytida saralanadi (1). Qobiq vositachiligidagi saralashdan tashqari, ba'zi lipidlar ularni ma'lum oqsillar bilan bir xil membrana domenlariga klasterlash orqali tanlab chiqish nuqtalari bo'lib xizmat qilishi mumkinligi uzoq vaqtdan beri taxmin qilinmoqda (2-5). Biroq, bu mumkin bo'lgan lipidga asoslangan mexanizmni isbotlash uchun in vivo to'g'ridan-to'g'ri dalillar hali ham yetishmaydi. Ushbu asosiy muammoni hal qilish uchun biz xamirturushda glikosilfosfatidilinozitol (GPI) bilan bog'langan oqsillar (GPI-AP) ER dan qanday qilib differentsial ravishda eksport qilinishini o'rgandik. GPI-APlar lipidlar bilan bog'langan hujayra yuzasi oqsillarining xilma-xilligidir (6, 7). GPI-AP - bu plazma membranasining tashqi varaqlariga glikolipid qismi (GPI langari) orqali biriktirilgan ajratilgan oqsil. Ular GPI langarlarini ER lümeninde konservativ post-translatsion modifikatsiyalar sifatida qabul qiladilar (8). Biriktirilgandan so'ng, GPI-AP Golgi apparati (5, 9) orqali ER dan plazma membranasiga o'tadi. GPI langarlarining mavjudligi GPI-AP ning transmembran ajratilgan oqsillardan (shu jumladan, boshqa plazma membrana oqsillaridan) sekretor yo'l bo'ylab alohida tashilishiga olib keladi (5, 9, 10). Xamirturush hujayralarida GPI-APlar endoplazmatik retikulumdagi boshqa ajratilgan oqsillardan ajralib chiqadi va keyin II qavat oqsil kompleksi (COPII) bilan o'ralgan noyob vesikulalarga qadoqlanadi (6, 7). ER eksport jarayonida ushbu tasniflash jarayonining determinantlari noma'lum, ammo bu mexanizm lipidlarni, ayniqsa GPI langarining lipid qismini strukturaviy qayta qurishni talab qilishi mumkin deb taxmin qilinadi (5, 8). Xamirturushda GPI lipid qayta qurish GPI biriktirilgandan so'ng darhol boshlanadi va ko'p hollarda u keramidning 26-uglerodli uzun zanjirli to'yingan yog 'kislotasiga (C26:0) bog'lanishiga olib keladi (11, 12). C26 keramidi xamirturush hujayralari tomonidan hozirgacha ishlab chiqarilgan asosiy keramid hisoblanadi. U ERda sintezlanadi va uning katta qismi COPII pufakchalari orqali Golgi apparatiga eksport qilinadi (13). GPI-AP ning ER eksporti, xususan, doimiy keramid sintezini talab qiladi (14, 15) va o'z navbatida, Golgi apparatida keramidning inozitol fosfat keramidiga (IPC) aylanishi GPI langar sinteziga bog'liq (16). Sun'iy membranalar bilan o'tkazilgan biofizik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, juda uzun asil zanjirli keramidlar noyob fizik xususiyatlarga ega tartibli domenlarni hosil qilish uchun birlashishi mumkin (17, 18). Bu ma'lumotlar C26 keramidi va C26 keramidi bilan GPI-AP o'zlarining fizik xususiyatlaridan foydalanib, nisbatan tartibsiz ER membrana lipid muhitida tartibli mintaqalarga yoki mintaqalarga birlashadi degan gipotezaga olib keladi. U asosan qisqa va to'yinmagan glitserolipidlardan (C16:1 va C18:1) iborat (19, 20). Bu mintaqalar tanlab, ma'lum ER chiqish joylariga (ERES) yo'naltiriladi, bu yerda seramid va seramid asosidagi GPI-AP bir xil maxsus COPII vezikulasida Golgiga birgalikda tashilishi mumkin (5).
Ushbu tadqiqotda biz ushbu lipidga asoslangan mexanizmni bir vaqtning o'zida lyuminestsent yorliqlangan oqsillarni kuzatish imkonini beruvchi zamonaviy mikroskopiya texnikasi bo'lgan super aniqlikdagi konfokal real vaqt rejimidagi tasvirlash mikroskopiyasi (SCLIM) yordamida to'g'ridan-to'g'ri sinovdan o'tkazdik. Uch rangli va uch o'lchovli (3D) tasvirlar tirik hujayralarda juda yuqori aniqlik va tezlikka ega (21, 22).
Biz dastlab SCLIM texnologiyasini qo'lladik, bunda C26 keramid guruhiga ega normal GPI-AP S. cerevisiae dagi ER dan chiqqandan keyin transmembran ajratilgan oqsillardan qanday skrining qilinganligi aniqlandi. ER tasnifini tekshirish uchun biz in vivo ERES ga kirayotgan yangi sintezlangan yuklarni to'g'ridan-to'g'ri vizualizatsiya qila oladigan genetik tizimdan foydalandik (7, 23). Yuk sifatida biz yashil lyuminestsent oqsil (GFP) bilan belgilangan C26 keramid asosidagi GPI-AP Gas1 va yaqin infraqizil lyuminestsent oqsil (iRFP) bilan belgilangan transmembran ajratilgan Mid2 oqsilini tanladik, ularning ikkalasi ham plazma membranasini nishonga oladi (24-26). sec31-1 haroratga sezgir mutantida bu ikki yuk galaktoza induktsiyalanadigan promotor va konstitutiv ERES marker ostida ifodalanadi. Haddan tashqari haroratda (37°C), sec31-1 mutatsiyasi COPII qoplama komponenti Sec31 ning COPII rivojlanishini va ER eksportini inhibe qilish funktsiyasiga ta'sir qilganligi sababli, yangi sintezlangan yuklar ER da to'planadi (23). Past haroratgacha (24°C) sovutilgandan so'ng, sec31-1 mutant hujayralari sekretor sohadan tiklandi va to'plangan yangi sintetik yuklar ER dan eksport qilina boshladi. CLIM vizualizatsiyasi shuni ko'rsatdiki, yangi sintezlangan Gas1-GFP va Mid2-iRFP ning aksariyati 37°C da inkubatsiyadan keyin ham sec31-1 mutant hujayralarining ER da to'planib, keyin 24°C da 5 daqiqa davomida qo'yib yuborilgan (1-rasm). Mid2-iRFP butun ER membranasida tarqalganligi va Gas1-GFP uzluksiz ER membranasi sohasida konsentratsiyalangan va to'planganligi sababli, ularning tarqalishi butunlay boshqacha (1-rasm, A dan C gacha va S1 filmi). Bundan tashqari, 1D-rasmda ko'rsatilganidek, Gas1-GFP klasterida Mid2-iRFP yo'q. Bu natijalar GPI-AP va transmembran oqsillari erta turli ER membrana sohalariga ajratilganligini ko'rsatadi. Gas1-GFP klasteri mCherry'ning COPII qoplama oqsili Sec13 (1-rasm, E va F va S1 filmi) bilan belgilangan ma'lum bir ERESga tutashgan (23).
sec31-1 hujayralari galaktoza keltirib chiqaradigan sekretsiyalarni ifodalaydi, uzun asil zanjiri (C26) seramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, yashil) va transmembran oqsili Mid2-iRFP (TMP, ko'k) va bu konstruktiv ERES yorlig'i Sec13-mCherry (ERES, binafsha rang) 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, 24°C ga ko'chirildi va 5 daqiqadan so'ng SCLIM tomonidan tasvirga olindi. (A dan C gacha) tekislikning vakillik birlashtirilgan yoki bitta 2D tasvirini (A), 10 z-kesimning 2D proyeksiya tasvirini (B) yoki yuk va ERES markerlarining 3D hujayra yarim shar tasvirini (C) ko'rsatadi. Masshtab chizig'i 1μm (A va B). Masshtab birligi 0,551μm (C). Gas1-GFP diskret ER mintaqalarida yoki klasterlarida aniqlandi, Mid2-iRFP esa ER membranasi bo'ylab aniqlandi va tarqatildi (C). (D) Grafik Gas1-GFP klasteridagi Gas1-GFP va Mid2-iRFP ning nisbiy lyuminestsentsiya intensivligini oq strelka chizig'i (chapda) bo'ylab ko'rsatadi. AU, ixtiyoriy birlik. (E va F) tovarlar va ERES belgisini birlashtirgan 3D tasvirni ifodalaydi. Gas1-GFP klasterlari ma'lum ERES yaqinida aniqlandi. Masshtab birligi 0,551 μm. (F) Oq rangli qattiq strelka ERES bilan bog'liq Gas1-GFP klasterini belgilaydi. O'rta va o'ng panellar birlashtirilgan kattalashtirilgan 3D tasvirni va tanlangan Gas1-GFP klasterining aylantirilgan ko'rinishini ko'rsatadi.
Gas1-GFP klasteri va ma'lum bir ERES o'rtasidagi yaqin fazoviy bog'liqlik Gas1-GFP selektiv ERESga kirishi mumkinligini ko'rsatadi, bu Mid2-iRFP tomonidan ERdan chiqish uchun ishlatiladigan selektivlikdan farq qiladi. Ushbu imkoniyatni hal qilish uchun biz ERES nisbatini faqat bitta yoki ikkita tovar uchun aniqladik (2-rasm, A dan C gacha). Ko'pgina ERES (70%) faqat bitta turdagi yukni o'z ichiga olishini aniqladik. 2C-rasmning pastki rasmida faqat Gas1-GFP (1-rasm) yoki faqat Mid2-iRFP (2-rasm) bo'lgan ERESning ikkita odatiy misoli ko'rsatilgan. Aksincha, ERESning taxminan 20% bir xil hududda bir-birining ustiga chiqadigan ikkita yukni o'z ichiga oladi. Ba'zi ERES (10%) ikki turdagi yukni o'z ichiga olganligi aniqlandi, ammo ular aniq turli hududlarda ajratilgan. Shuning uchun, ushbu statistik tahlil shuni ko'rsatadiki, ER eksport qilingandan so'ng, GPI-AP Gas1-GFP va transmembran yuk Mid2-iRFP turli ERESlarga bo'linadi (2D-rasm). Bu saralash samaradorligi avvalgi biokimyoviy tahlil (6) va morfologik aniqlash (7) bilan juda mos keladi. Shuningdek, biz ERESga kiruvchi karantindagi yukning xatti-harakatlarini kuzatishimiz mumkin (2E-rasm va S2 filmi). 2E-rasmda Gas1-GFP (3-panel) yoki Mid2-iRFP (4-panel) ning faqat kichik bir qismi ERESga bir tomondan kirishi va alohida hududda joylashganligi ko'rsatilgan. 2E-rasmning 5-panelida Gas1-GFP va Mid2-iRFP ba'zan bir xil ERESda topilishi, ammo ular turli tomonlardan kirishi va turli COPII vesikulalarini ifodalashi mumkin bo'lgan alohida mintaqalarda to'planganligi ko'rsatilgan. Shuningdek, biz C26 keramid asosidagi GPI-AP Gas1 ning selektiv ERES sifatida kuzatilgan ajralishi va tasnifi o'ziga xos ekanligini tasdiqladik, chunki boshqa transmembran sekretsiya yuki, GFP bilan belgilangan plazma membranasi oqsili Axl2 (27) Mid2-iRFPga o'xshash xatti-harakatni ko'rsatadi. (S1-rasm va S3 filmi). Yangi sintezlangan Axl2-GFP ER membranasi orqali Mid2-iRFP kabi taqsimlanadi (S1, A va B-rasm) va ko'pgina ERESlarda Mid2-iRFP bilan birgalikda joylashadi (S1, B dan D gacha). 1-rasmning 1 va 2-panellari. S1C ikkita transmembran yuklari bir-birining ustiga chiqadigan ERESning ikkita odatiy misolini ko'rsatadi. Bunday hollarda ikkala yuk ham ERESga birga kiradi (S1E-rasm, 3-panel va S3-film).
Galaktoza induktsiyalanadigan sekretsiyalarni ifodalovchi sec31-1 hujayralari, Gas1-GFP (GPI-AP, yashil) va Mid2-iRFP (TMP, ko'k) va Sec13-mCherry (ERES, binafsha rang) konstitutiv ERES yorlig'i 37 ga joylashtirildi. °C da 30 daqiqa inkubatsiya qilingandan so'ng, sekretsiya blokini chiqarish uchun 24 °C ga o'ting va 20 daqiqadan so'ng SCLIM yordamida tasvir oling. (A dan C gacha) Yukning va ERES bilan belgilangan 10 ta z-kesimining vakillik 2D proyeksiya tasvirlari (A; masshtab chizig'i, 1μm) yoki 3D hujayra yarim shar tasvirlari (B va C; masshtab birligi, 0,456μm). (B) dagi pastki panel va (C) dagi panel faqat ERESda mavjud bo'lgan tovarlarni (binafsha rang) ko'rsatish uchun qayta ishlangan tasvirlarni namoyish etadi [Gas1-GFP (kulrang) va Mid2-iRFP (och ko'k)]. (C) Ochiq strelka: ERES faqat bitta yukni tashiydi (1 dan 4 gacha). Kulrang strelka: ERES ajratilgan yukni o'z ichiga oladi (5). Oq rangli qattiq strelka: birga joylashgan yukni o'z ichiga olgan ERES. Quyida: Tanlangan bitta ERES faqat Gas1-GFP (1) yoki Mid2-iRFP (2) ni o'z ichiga oladi. Masshtab chizig'i, 100 nm. (D) (C) da tasvirlangan fotomikrografning miqdoriy ko'rsatkichi. Faqat bitta yukni (Gas1-GFP yoki Mid2-iRFP), ajratilgan yukni va bir-birining ustiga chiqadigan yukni o'z ichiga olgan ERESning o'rtacha foizi. Uchta mustaqil tajribada 54 katakchada n=432. Xato chizig'i = SD. Ikki dumli juftlashtirilmagan t-test. *** P = 0.0002. (E) (C) bilan belgilangan karantindagi yukning tanlangan ERES ning 3D tasviri. Gas1-GFP (yashil) (3) yoki Mid2-iRFP (ko'k) (4) ERES (qizil) ga bir tomondan kiradi va ERES ichidagi kichik maydon bilan cheklangan. Ba'zan ikkala turdagi yuk ham bir xil ERESga (5) bir tomondan kiradi va ERES ichidagi izolyatsiya qilingan hudud bilan chegaralanadi. Masshtab chizig'i, 100 nm.
Keyin, biz ER membranasida mavjud bo'lgan uzun asil zanjirli keramid (C26) Gas1 ning o'ziga xos klasterlanishi va selektiv ERESga saralanishini boshqaradi degan gipotezani sinab ko'rdik. Shu maqsadda biz modifikatsiyalangan GhLag1 xamirturush shtammidan foydalandik, unda ikkita endogen keramid sintazalari Lag1 va Lac1 GhLag1 (paxtaning Lag1 gomologi) bilan almashtirildi, natijada hujayra membranasi yovvoyi turdan qisqaroq keramid shtammiga ega xamirturush shtammi paydo bo'ldi (3A-rasm) (28). Mass-spektrometriya (MS) tahlili shuni ko'rsatdiki, yovvoyi turdagi shtammlarda umumiy keramidning 95% juda uzun (C26) zanjirli keramid, GhLag1 da esa keramidning 85% juda uzun (C18 va C16) dir. ), keramidning atigi 2% juda uzun (C26) zanjirli keramiddir. Garchi hozirgacha GhLag1 membranasida aniqlangan asosiy seramidlar C18 va C16 seramidlar bo'lsa-da, MS tahlili shuningdek, GhLag1 shtammida ifodalangan Gas1-GFP ning GPI langari tarkibida yovvoyi tipdagi lipidlar bilan taqqoslanadigan C26 seramid borligini tasdiqladi. Sifati bir xil (3A-rasm) (26). Shuning uchun, bu Cwh43 seramidni qayta tuzuvchi fermenti C26 seramid uchun yuqori darajada selektiv ekanligini anglatadi, 26-rasmda ko'rsatilganidek, u GhLag1 shtammidagi oz miqdordagi C26 seramiddan GPI langarini afzal ko'radi. S2 (29). Shunga qaramay, GhLag1 ning hujayra membranasi asosan faqat C18-C16 seramidni o'z ichiga oladi, Gas1-GFP esa hali ham C26 seramidga ega. Bu fakt ushbu shtammni ERdagi membrana seramidining asil zanjir uzunligi muammosini maxsus hal qilish uchun ideal vositaga aylantiradi. Sinf va saralashning gipotetik roli. Keyin, biz avval C26 Gas1-GFP ning GhLag1 da sec31-1 haroratga sezgir mutant alleli bilan klasterlarda to'planish qobiliyatini an'anaviy lyuminestsent mikroskopiya orqali o'rgandik, bu yerda ER membranasi Ceramidda faqat uzun (C18-C16) zanjir mavjud (3-rasm). Biz 31-1-bo'limda Gas1-GFP ning ko'p qismi klasterlarda to'planganligini, uzun (C18-C16) uzun keramid ER membranasiga ega sec31-1 GhLag1 da Gas1-GFP esa asosan klasterlanmaganligini va butun ER membranasida taqsimlanmaganligini kuzatdik. Aniqroq aytganda, C26 keramid asosidagi klasterlash ma'lum ERES bilan chambarchas bog'liq bo'lganligi sababli (1-rasm), biz keyin bu jarayon ER eksport oqsili mexanizmining funktsiyasini ham o'z ichiga olishi mumkinligini tekshirdik. GPI-AP ER eksporti uchun maxsus COPII tizimidan foydalanadi, bu esa Ted1 ning GPI langarining glikan qismini strukturaviy qayta qurishi bilan faol ravishda tartibga solinadi (30, 31). Keyin rekombinant GPI-glikan transmembran yuk retseptorlari p24 kompleksi tomonidan tan olinadi, bu esa o'z navbatida asosiy COPII yuk bog'lovchi subbirligi Sec24 ning o'ziga xos izoformi bo'lgan Lst1 ni tanlab jalb qiladi va GPI-AP ga boy COPII vesikulalarini hosil qiladi (31-33). Shuning uchun biz ushbu bitta oqsillarning (p24 kompleks komponenti Emp24, GPI-glikanni qayta tuzuvchi ferment Ted1 va o'ziga xos COPII subbirligi Lst1) o'chirilishini sec31-1 mutant shtammi bilan birlashtirgan qo'shaloq mutantni yaratdik va ularni o'rgandik. Gas1-klasterli GFP hosil qilish mumkinmi (3-rasm). Biz sec31-1emp24Δ va sec31-1ted1Δ da Gas1-GFP asosan klasterlanmagan va ER membranasi bo'ylab taqsimlanganligini kuzatdik, bu avval sec31-1 GhLag1 da ko'rilganidek, sec31-1lst1Δ da esa Gas1-GFP sec31-1 kabi. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, ER membranasida C26 keramidining mavjudligidan tashqari, Gas1-GFP klasterlanishi ham p24 kompleksiga bog'lanishi kerak va maxsus Lst1 jalb qilishni talab qilmaydi. Keyin, biz ER membranasidagi keramidning zanjir uzunligi Gas1-GFP ning p24 ga bog'lanishini tartibga solishi mumkinligini o'rganib chiqdik. Biroq, biz membranada C18-C16 keramidining mavjudligi p24 kompleksi tomonidan qayta tiklangan GPI-glikanlarga (S3 va S4-rasmlar, A va B) yoki GPI-AP ga bog'lanish va GPI-AP eksport qilish qobiliyatiga ta'sir qilmasligini aniqladik. COPII kichik turi Lst1 ni ishga oling (S4C-rasm). Shuning uchun, C26 keramidga bog'liq klasterlash oqsilning turli ER eksport oqsil mexanizmlari bilan o'zaro ta'sirini talab qilmaydi, lekin lipid uzunligi bilan boshqariladigan muqobil saralash mexanizmini qo'llab-quvvatlaydi. Keyin, biz ER membranasidagi keramid asil zanjiri uzunligi Gas1-GFP ni selektiv ERES sifatida samarali tasniflash uchun muhimligini tahlil qildik. Qisqa zanjirli keramidli GhLag1 shtammidagi Gas1 ER dan chiqib, plazma membranasiga kirganligi sababli (S5-rasm), agar saralash keramid asil zanjiri uzunligi bilan boshqarilsa, GhLag1 shtammidagi Gas1 yo'naltirilishi va kesishishi mumkinligiga ishonamiz. Xuddi shu membranaga ega ERES tovarlari.
(A) GhLag1 hujayra membranasi asosan qisqaroq C18-C16 keramidlarini o'z ichiga oladi, Gas1-GFP ning GPI langari esa yovvoyi tipdagi hujayralar bilan bir xil C26 IPC ga ega. Yuqorida: yovvoyi tipdagi (Wt) va GhLag1p shtammlarining hujayra membranasidagi keramidning asil zanjir uzunligi tahlili massa spektrometriyasi (MS) yordamida. Ma'lumotlar umumiy keramidning foizini ifodalaydi. Uchta mustaqil tajribaning o'rtacha qiymati. Xato satri = SD. Ikki dumli juftlashtirilmagan t-test. **** P <0.0001. Pastki panel: yovvoyi tipdagi va GhLag1p shtammlarida ifodalangan Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI langarida mavjud bo'lgan IPC ning asil zanjir uzunligining MS tahlili. Ma'lumotlar umumiy IPC signalining foizini ifodalaydi. Beshta mustaqil tajribaning o'rtacha qiymati. Xato satri = SD. Ikki dumli juftlashtirilmagan t-test. ns, muhim emas. P = 0.9134. (B) Galaktoza bilan induktsiyalangan Gas1-GFP ni ifodalovchi sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ va sec31-1lst1Δ hujayralarining lyuminestsent mikrografiyalari 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va 24°C dan keyin odatiy lyuminestsent mikroskopiyasini bajarish uchun pastga o'tkazildi. Oq strelka: ER Gas1-GFP klasteri. Ochiq strelka: Klasterlanmagan Gas1-GFP butun ER membranasida taqsimlangan bo'lib, ER ga xos yadro halqasini bo'yashni ko'rsatadi. Masshtab chizig'i, 5μm. (C) (B) da tasvirlangan fotomikrografning miqdoriy ko'rsatkichi. Nuqtali Gas1-GFP tuzilishga ega hujayralarning o'rtacha foizi. Uchta mustaqil tajribada n≥300 hujayra. Xato chizig'i = SD. Ikki dumli juftlashtirilmagan t-test. **** P <0.0001.
Ushbu muammoni to'g'ridan-to'g'ri hal qilish uchun biz GhLag1 da sec31-1 haroratga sezgir mutant alleli bilan Gas1-GFP va Mid2-iRFP ni SCLIM vizualizatsiyasini amalga oshirdik (4-rasm va S4 filmi). ER 37°C da ushlab turilgandan va keyinchalik 24°C da chiqarilgandan so'ng, an'anaviy mikroskoplar tomonidan kuzatilganidek, yangi sintezlangan Gas1-GFP ning ko'p qismi klasterlanmagan va ER membranasi bo'ylab tarqalmagan (4-rasm, A va B). Bundan tashqari, ERES ning katta foizi (67%) unda birga joylashgan ikki turdagi yukni o'z ichiga oladi (4D-rasm). 4C-rasmning 1 va 2-panellarida Gas1-GFP va Mid2-GFP bir-birining ustiga chiqqan ERES ning ikkita tipik misoli ko'rsatilgan. Bundan tashqari, ikkala mahsulot ham bir xil ERESga jalb qilingan (4E-rasm, 3-panel va S4 filmi). Shuning uchun, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, ER membranasidagi keramid asil zanjirining uzunligi ER oqsilining agregatsiyasi va tasnifining muhim determinanti hisoblanadi.
Sec31-1 Galaktoza keltirib chiqaradigan sekretsiyalarni ifodalovchi GhLag1 hujayralari, Gas1-GFP (GPI-AP, yashil) va Mid2-iRFP (TMP, ko'k) va ERES bilan belgilangan Sec13-mCherry (ERES, binafsha rang). 37°C da inkubatsiya qiling. 30 daqiqa davomida davom eting, sekretsiyalarni chiqarish uchun 24°C ga tushiring va 20 daqiqadan so'ng SCLIM yordamida tasvirga oling. (A dan C gacha) Yuk va ERES bilan belgilangan 10 z-kesimning vakillik 2D proyeksiya tasvirlari (A; masshtab chizig'i, 1μm) yoki 3D hujayra yarim shar tasvirlari (B va C; masshtab birligi, 0,45μm). (B) dagi pastki panel va (C) dagi panel faqat ERESda mavjud bo'lgan tovarlarni (binafsha rang) ko'rsatish uchun qayta ishlangan tasvirlarni ko'rsatadi [Gas1-GFP (kulrang) va Mid2-iRFP (och ko'k)]. (C) Oq rang bilan to'ldirilgan strelka: ERES, tovarlar bir-birining ustiga chiqadi. Ochiq strelka: ERES faqat bitta elementni o'z ichiga oladi. Pastki panel: Tanlangan ERES (C) da belgilangan bir-birining ustiga chiqadigan tovarlarga (1 va 2) ega. Masshtab satri, 100 nm. (D) (C) da tasvirlangan fotomikrografning miqdoriy ko'rsatkichi. 31-1-bo'lim va 31-1-bo'lim GhLag1 birliklarida faqat bitta yuk (Gas1-GFP yoki Mid2-iRFP) va ajratilgan yuk va bir-birining ustiga chiqadigan yuklar uchun ERESning o'rtacha foizi kiritilgan. Uchta mustaqil tajribada 54 katakchada n = 432 (31-1-bo'lim) va 47 katakchada n = 430 (31-1-bo'lim GhLag1). Xato satri = SD. Ikki dumli juftlashtirilmagan t-test. *** P = 0.0002 (31-1-bo'lim) va ** P = 0.0031 (31-1-bo'lim GhLag1). (E) (C) da belgilangan bir-birining ustiga chiqadigan yuk (3) bilan tanlangan ERESning 3D tasviri. Gas1-GFP (yashil) va Mid2-iRFP (ko'k) ERESga (binafsha) bir tomondan yaqinlashadi va bir xil ERES cheklangan hududida qoladi. Masshtab chizig'i, 100 nm.
Ushbu tadqiqot lipid asosidagi oqsil yuklarining sekretor yo'lda selektiv eksport joylariga tasniflanganligi haqida in vivo dalillarni taqdim etadi va tasniflash selektivligi uchun atsil zanjiri uzunligining ahamiyatini ochib beradi. SCLIM deb nomlangan kuchli va zamonaviy mikroskopiya texnikasidan foydalanib, biz xamirturushda yangi sintezlangan Gas1-GFP (juda uzun atsil zanjiri (C26) keramid lipid qismiga ega bo'lgan asosiy plazma membranasi GPI-AP) ni namoyish etdik. ) Diskret ERlarda klasterlangan mintaqalar ma'lum ERES bilan bog'liq, transmembran ajratilgan oqsillar esa ER membranasi bo'ylab taqsimlangan (1-rasm). Bundan tashqari, bu ikki turdagi tovarlar turli ERESga selektiv ravishda kiradi (2-rasm). Membranadagi hujayrali keramidning atsil zanjiri uzunligi C26 dan C18-C16 gacha kamayadi, Gas1-GFP klasteri diskret ER mintaqasiga parchalanadi va Gas1-GFP transmembran oqsili bilan ERni bir xil ERES orqali qoldirish uchun qayta yo'naltiriladi (3-rasm va 3-rasm). 4).
GPI-AP ER dan chiqish uchun ixtisoslashgan oqsil mexanizmidan foydalansa-da, biz C26 keramidga bog'liq ajralish ERES ixtisoslashuviga olib kelishi mumkin bo'lgan differentsial oqsil o'zaro ta'siriga bog'liq emasligini aniqladik (S4 va S5-rasmlar). Buning o'rniga, bizning topilmalarimiz lipidga asoslangan oqsil klasterlash va keyinchalik boshqa yuklarni chiqarib tashlash orqali boshqariladigan muqobil tasniflash mexanizmini qo'llab-quvvatlaydi. Bizning kuzatishlarimiz shuni ko'rsatadiki, ma'lum bir ERES bilan bog'liq Gas1-GFP mintaqasi yoki klasterida transmembran ajralib chiqadigan Mid2-iRFP oqsili yo'q, bu C26 keramidga bog'liq GPI-AP klasteri ularning tegishli ERESga kirishini osonlashtirishini va shu bilan birga transmembranni chiqarib tashlashini ko'rsatadi. Sekretsiyalar ushbu aniq ERESga kiradi (1 va 2-rasmlar). Aksincha, ER membranasida C18-C16 keramidlarining mavjudligi GPI-AP ning mintaqalar yoki klasterlar hosil bo'lishiga olib kelmaydi, shuning uchun ular transmembran ajralib chiqadigan oqsillarni bir xil ERESga chiqarib tashlamaydi yoki almashtirmaydi (3 va 4-rasmlar). Shuning uchun biz C26 keramidi ma'lum ERES bilan bog'langan oqsillarni klasterlashni osonlashtirish orqali ajratish va tasniflashni boshqaradi, deb taklif qilamiz.
Ushbu C26 keramidga bog'liq klasterizatsiyani ma'lum bir ER maydoniga qanday erishish mumkin? Membrana keramidining lateral ravishda ajralish tendentsiyasi GPI-AP va C26 keramidining qisqaroq va to'yinmagan glitserolipidlarni o'z ichiga olgan ER membranasining tartibsiz lipid muhitida kichik va bir zumda tartiblangan lipidlar hosil bo'lishiga olib kelishi mumkin. Sifat klasterlari (17, 18). Bu kichik vaqtinchalik klasterlar p24 kompleksiga bog'langandan so'ng kattaroq, barqarorroq klasterlarga qo'shilishi mumkin (34). Bunga muvofiq, biz C26 Gas1-GFP kattaroq ko'rinadigan klasterlarni hosil qilish uchun p24 kompleksi bilan o'zaro ta'sir qilishi kerakligini ko'rsatdik (3-rasm). p24 kompleksi xamirturushdagi to'rt xil p24 transmembran oqsillaridan tashkil topgan heterozigotli oligomerdir (35), bu ko'p valentli bog'lanishni ta'minlaydi, bu esa kichik GPI-AP klasterlarining o'zaro bog'lanishiga olib kelishi mumkin va shu bilan kattaroq barqaror klasterni hosil qiladi (34). GPI-APlarning oqsil ektodomenlari orasidagi o'zaro ta'sir, shuningdek, sutemizuvchilarning qutblangan epitelial hujayralarida Golgi tashish paytida ko'rsatilganidek, ularning agregatsiyasiga hissa qo'shishi mumkin (36). Biroq, ER membranasida C18-C16 keramidi mavjud bo'lganda, p24 kompleksi Gas1-GFP ga bog'langanda, katta alohida klasterlar hosil bo'lmaydi. Asosiy mexanizm uzun asil zanjirli keramidning o'ziga xos fizik va kimyoviy xususiyatlariga bog'liq bo'lishi mumkin. Sun'iy membranalarning biofizik tadqiqotlari shuni ko'rsatadiki, ham uzun (C24), ham qisqa (C18-C16) asil zanjirli keramidlar fazalarning ajralishiga olib kelishi mumkin bo'lsa-da, faqat uzun asil zanjirli keramidlar (C24) yuqori egrilik va plyonkaning egilishini rag'batlantirishi mumkin, bu esa plyonkani qayta shakllantiradi. O'zaro ma'lumotnoma orqali (17, 37, 38). Emp24 ning inson gomologi bo'lgan TMED2 ning transmembran spirali sitoplazmatik lobulalarda C18 keramid asosidagi sfingomielin bilan tanlab o'zaro ta'sir qilishi ko'rsatilgan (39). Molekulyar dinamika (MD) simulyatsiyalaridan foydalanib, biz C18 va C26 keramidlarining ham Emp24 transmembran spiralining sitoplazmatik lobulalari atrofida to'planishini va ularning o'xshash afzalliklari borligini aniqladik (S6-rasm). Shuni ta'kidlash kerakki, bu Emp24 ning transmembran spirali membranada lipidlarning assimetrik taqsimlanishiga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi. Bu sutemizuvchi hujayralarga asoslangan so'nggi natija. Shunga o'xshash MD simulyatsiyalari efir lipidlarining mavjudligini ham ko'rsatadi (40). Shuning uchun, biz ER26 ning ikkita lobulasida C26 keramidining mahalliy darajada boyitilgan deb taxmin qilamiz. Luminal lobulalardagi GPI-AP to'g'ridan-to'g'ri ko'p valentli p24 ga bog'langanda va sitoplazmatik lobulalarda p24 atrofida C26 keramidining to'planishi kuzatilganda, u barmoqlar orqali oqsil agregatsiyasini va membrana egriligini hosil qiladi (41), bu esa GPI-AP ning ERES yonidagi alohida mintaqalarga ajralishiga olib keladi, bu esa ER membranasining yuqori egri mintaqalariga ham yordam beradi (42). Avvalgi hisobotlar taklif qilingan mexanizmni qo'llab-quvvatladi (43, 44). Plazma membranasida oligolektinlar, patogenlar yoki antikorlarning keramid asosidagi glikosfingolipidlarga (GSL) ko'p valentli bog'lanishi katta GSL agregatsiyasini qo'zg'atadi, fazaviy ajralishni kuchaytiradi va membrana deformatsiyasi va ichkilashuviga olib keladi (44). Iwabuchi va boshqalar. (43) Uzoq (C24), ammo qisqa (C16) bo'lmagan asil zanjirlar mavjud bo'lganda, GSL laktosilseramidiga bog'langan ko'p valentli ligand katta klasterlarning shakllanishiga va membrana invaginatsiyasiga sabab bo'lganligi va sitoplazma varaqalaridagi Lyn vositachiligidagi signal transduksiyasi bog'langan neytrofillardagi asil zanjirlari bilan o'zaro bog'langanligi aniqlandi.
Sutemizuvchilarning qutblangan epitelial hujayralarida anti-Golgi tarmog'ining (TGN) apikal plazma membranasi darajasiga konsentratsiyasi GPI-AP ning ajralishi va saralanishini boshqaradi (10, 45). Bu agregatsiya GPI-AP oligomerizatsiyasi bilan boshqariladi (36), ammo u xamirturushda topadigan keramid zanjiri uzunligiga ham bog'liq bo'lishi mumkin. Sutemizuvchilarning GPI-AP efir lipid asosidagi langarga ega bo'lsa-da va uning kimyoviy tuzilishi juda uzun asil zanjirli keramiddan juda farq qilsa-da, yaqinda o'tkazilgan tadqiqot shuni ko'rsatdiki, ikkala lipid ham evolyutsion jihatdan o'xshash fizik va kimyoviy xususiyatlarga ega va funktsiyaga ega (40). Shuning uchun, sutemizuvchilar hujayralaridagi efir lipid qismi xamirturushdagi C26 keramidiga o'xshash bo'lishi mumkin va uning roli membranadagi uzun zanjirli keramid bilan bog'lanib, GPI-AP agregatsiyasini va saralanishini rag'batlantirishdir. Bu imkoniyat hali ham to'g'ridan-to'g'ri sinovdan o'tkazilishi kerak bo'lsa-da, avvalgi topilmalar uzun atil zanjirli keramidning Golgi tanasiga tashilishini sitoplazmatik uzatish oqsillari tomonidan amalga oshirilmasligini, balki xamirturush kabi GPI langarlarining sinteziga bog'liqligini tasdiqlaydi. Shuning uchun, evolyutsion konservativ mexanizm juda uzun atil zanjirli keramid va GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ni bir xil transport pufagida tanlab birgalikda tashishga qodir ko'rinadi.
Xamirturush va sutemizuvchilarning qutblangan epitelial hujayra tizimlarida GPI-AP agregatsiyasi va boshqa plazma membranasi oqsillaridan ajralish hujayra yuzasiga yetmasdan oldin sodir bo'ladi. Paladino va boshqalar (48) sutemizuvchilarning qutblangan epitelial hujayralarining TGNida GPI-AP klasterlanishi nafaqat GPI-APlarni apikal plazma membranasiga selektiv tasniflash uchun zarurligini, balki GPI-APlarning klasterlash tashkilotini va uning biologik faolligini ham tartibga solishini aniqladilar. Hujayra yuzasi. Xamirturushda ushbu tadqiqot ERdagi C26 keramidga bog'liq GPI-AP klasteri plazma membranasida GPI-AP ning klasterlash tashkilotini va funktsional faolligini tartibga solishi mumkinligini ko'rsatdi (24, 49). Ushbu modelga muvofiq, GhLag1 hujayralari GPI ingibitorlariga yoki hujayra devori yaxlitligiga ta'sir qiluvchi dorilarga allergiyaga ega (28) va xamirturush hujayralarining juftlashishida proektsiyalangan uchli keramidning funktsional Gas1-GFP klasterlariga ehtiyoj (49) G ni ko'rsatadi. hLag1 hujayralarining mumkin bo'lgan fiziologik oqibatlari. GPI-AP xatosi. Biroq, hujayra yuzasining funktsional tashkil etilishi lipid uzunligiga asoslangan saralash usuli bilan ER dan dasturlashtirilganligini qo'shimcha tekshirish bizning kelajakdagi tadqiqotlarimiz mavzusi bo'ladi.
Ushbu ishda ishlatilgan Saccharomyces cerevisiae shtammlari S1 jadvalida keltirilgan. Tirik hujayra tasvirlari uchun SCLIM ning MMY1583 va MMY1635 shtammlari W303 fonida yaratilgan. Sec13-mCherry ni lyuminestsent oqsil yorlig'i bilan ifodalovchi bu shtammlar shablon sifatida pFA6a plazmidasi bilan polimeraza zanjiri reaksiyasi (PCR) asosidagi usul yordamida yaratilgan (23). GAL1 promotori nazorati ostida lyuminestsent oqsil bilan belgilangan Mid2-iRFP ni ifodalovchi shtamm quyidagicha yaratilgan. pKTiRFP-KAN vektoridan iRFP-KanMx ketma-ketligining PCR amplifikatsiyasi (E. O'Shea sovg'asi, Addgene plazmid raqami 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; tadqiqot resurs identifikatori (RRID): Addgene_64687) Va endogen Mid2 ning C-terminaliga kiritilgan. Mid2-iRFP genom ketma-ketligi kuchaytirilib, GAL1 promouteriga klonlangandan so'ng, u pRS306 integratsiya plazmidining Not I-Sac I saytiga integratsiya qilindi. Olingan pRGS7 plazmidasi URA3 lokusiga integratsiya qilish uchun Pst I bilan chiziqlilashtirildi.
Gas1-GFP sintez geni GAL1 promouteri nazorati ostida sentromer (CEN) plazmidida ifodalanadi, u quyidagicha tuzilgan. Gas1-GFP ketma-ketligi pRS416-GAS1-GFP plazmididan (24) (L. Popolo sovg'asi) PCR orqali kuchaytirildi va CEN plazmidasi pBEVY-GL LEU2 (C sovg'asi) ning Xma I–Xho I saytiga klonlandi. Miller; Addgene plazmid raqami 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Olingan plazmid pRGS6 deb nomlandi. Axl2-GFP sintez geni ham pBEVY-GL LEU2 vektorining GAL1 promouteri nazorati ostida ifodalanadi va uning tuzilishi quyidagicha. Axl2-GFP ketma-ketligi pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmididan (23) PCR orqali kuchaytirildi va pBEVY-GL LEU2 vektorining Bam HI-Pst I saytiga klonlandi. Olingan plazmid pRGS12 deb nomlandi. Ushbu tadqiqotda ishlatilgan oligonukleotidlarning ketma-ketligi S2 jadvalida keltirilgan.
Shtamm uglerod manbai sifatida 0,2% adenin va 2% glyukoza [YP-dekstroza (YPD)], 2% rafinozaga [YP-rafinoz] boy xamirturush ekstrakti oqsili p (YP) muhiti (1% xamirturush ekstrakti va 2% protein ept). (YPR)] yoki 2% galaktoza [YP-galaktoza (YPG)] bilan to'ldirildi, yoki ozuqaviy moddalar uchun zarur bo'lgan tegishli aminokislotalar va asoslarni to'ldirish uchun sintetik minimal muhitda (0,15% xamirturush azot asosi va 0,5% ammoniy sulfat) qo'shildi va uglerod manbai sifatida 2% glyukoza (sintetik glyukoza minimal muhiti) yoki 2% galaktoza (sintetik galaktoza minimal muhiti) mavjud edi.
Real vaqt rejimida tasvirlash uchun GAL1 promotori ostida konstruksiyani ifodalovchi haroratga sezgir sec31-1 mutant hujayralari YPR muhitida 24°C da bir kechada o'rta log fazasiga qadar o'stirildi. YPGda 24°C da 1 soat davomida induktsiya qilingandan so'ng, hujayralar SG da 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin sekretsiya blokidan chiqish uchun 24°C ga o'tkazildi. Konkanavalin A hujayralarni shisha slaydga mahkamlash uchun ishlatilgan va SCLIM yordamida tasvirlangan. SCLIM - bu Olympus IX-71 teskari lyuminestsent mikroskopi va UPlanSApo 100×1.4 raqamli diafragma moyli linzasi (Olympus), yuqori tezlikdagi va yuqori signal-shovqin nisbatiga ega aylanadigan disk konfokal skaner (Yokogawa Electric), maxsus spektrometr va maxsus sovutishning kombinatsiyasi. Tizimning tasvir kuchaytirgichi (Hamamatsu Photonics) ×266.7 yakuniy kattalashtirishga ega kattalashtiruvchi linza tizimini va elektronlarni ko'paytiradigan zaryadlangan qurilma kamerasini (Hamamatsu Photonics) taqdim etishi mumkin (21). Tasvirni olish maxsus dasturiy ta'minot (Yokogawa Electric) tomonidan amalga oshiriladi. 3D tasvirlar uchun biz obyektiv linzasini vertikal ravishda tebratish uchun maxsus tayyorlangan piezoelektrik aktuatordan foydalandik va optik qismlarni 100 nm masofada stekka yig'dik. Z-stek tasviri 3D voksel ma'lumotlariga aylantiriladi va aylanadigan disk konfokal mikroskopi uchun ishlatiladigan nazariy nuqta tarqalishi funksiyasi Volocity dasturi (PerkinElmer) tomonidan dekonvolyutsiyani qayta ishlash uchun ishlatiladi. Volocity dasturidan foydalanib, kolokatsiya tahlili uchun avtomatik ravishda chegara o'rnatildi, shu jumladan yuklarni o'z ichiga olgan ERES o'lchandi. Chiziqlarni skanerlash tahlili MetaMorph dasturi (Molecular Devices) yordamida amalga oshirildi.
Statistik ahamiyatni aniqlash uchun GraphPad Prism dasturidan foydalaning. Ikki tomonlama Student t-testi va oddiy bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) testi uchun guruhlar orasidagi farqlar P <0.05 (*) ga sezilarli ta'sir ko'rsatadi deb hisoblanadi.
Gas1-GFP ning lyuminestsent mikroskopiyasi uchun log fazali hujayralar YPD da bir kechada o'stirildi va santrifugatsiya yo'li bilan yig'ildi, ikki marta fosfat tamponli sho'r suv bilan yuvildi va muz ustida kamida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va keyin avval tasvirlanganidek mikroskop ostida davom ettirildi (24-bet). Olish uchun obyektiv linza, L5 (GFP) filtri, Hamamatsu kamerasi va Application Suite X (LAS X) dasturi bilan jihozlangan Leica DMi8 mikroskopi (HCX PL APO 1003/1.40 moyli PH3 CS) ishlatilgan.
Namunalar 65°C da 10 daqiqa davomida SDS namunaviy buferi bilan denaturatsiya qilindi va keyin SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (PAGE) yordamida ajratildi. Immunoblotting tahlili uchun har bir yo'lakka 10 mkl namuna yuklandi. Birlamchi antikor: 1:3000 suyultirilganda quyon poliklonal anti-Gas1, 1:500 suyultirilganda quyon poliklonal anti-Emp24 va 1:3000 suyultirilganda quyon poliklonal anti-GFP (H. Riezmanning sovg'asi) dan foydalaning. Sichqoncha monoklonal anti-Pgk1 antikori 1:5000 suyultirilganda (J. de la Cruzning sovg'asi) ishlatilgan. Ikkilamchi antikor: 1:3000 suyultirilganda ishlatiladigan xren peroksidaza (HRP) konjuge qilingan echki anti-quyon immunoglobulini G (IgG) (Pierce). HRP bilan konjuge qilingan echki sichqonlarga qarshi IgG 1:3000 suyultirilganda (Pierce) ishlatilgan. Immun javob zonasi SuperSignal West Pico reaktivining (Thermo Fisher Scientific) xemiluminestsentsiya usuli bilan kuzatilgan.
(31) da tasvirlanganidek, boyitilgan ER fraksiyasida tabiiy immunoprecipitatsiya tajribasi o'tkazildi. Qisqasi, xamirturush hujayralarini TNE buferi [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil ftorid va proteaza inhibitori aralashmasi) bilan 600 nm (OD600) da 100 optik zichlikda ikki marta yuving. U shisha boncuklar bilan sindirildi, so'ngra hujayra qoldiqlari va shisha boncuklar santrifugalash orqali olib tashlandi. Keyin supernatant 17000 g da 4°C da 15 daqiqa davomida santrifugalandi. Pellet TNE da qayta suspenziya qilindi va digitalis saponin 1% yakuniy konsentratsiyaga qo'shildi. Süspansiyon 4°C da aylanish bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra erimaydigan komponentlar 13000 g da 4°C da 60 daqiqa davomida santrifugalash orqali olib tashlandi. Gas1-GFP immunoprecipitatsiyasi uchun avval namunani bo'sh agaroza boncuklari (ChromoTek) bilan 4°C da 1 soat davomida oldindan inkubatsiya qiling, so'ngra GFP-Trap_A (ChromoTek) bilan 4°C da 3 soat davomida inkubatsiya qiling. Immunoprecipitatsiya qilingan boncuklar 0,2% digoksigenin o'z ichiga olgan TNE bilan besh marta yuvildi, SDS namunaviy buferi bilan elyutlandi, SDS-PAGE da ajratildi va immunoblotting orqali tahlil qilindi.
(31) da tasvirlanganidek, o'zaro bog'lanishni aniqlash boyitilgan ER fraksiyasida amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, boyitilgan ER fraksiya 0,5 mM ditiobis (suksinimidil propionat) bilan inkubatsiya qilindi (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, AQSh; 20°C, 20 daqiqa). O'zaro bog'lanish reaksiyasi glitsin qo'shilishi bilan to'xtatildi (50 mM yakuniy konsentratsiya, 5 daqiqa, 20°C).
Avval tasvirlanganidek (50), yovvoyi tipdagi va GhLag1 shtammlarida keramidning MS tahlili o'tkazildi. Qisqasi, hujayralar YPD da 30°C da eksponensial fazaga (3 dan 4 OD600 birlik/ml gacha) o'stirildi va 25×107 hujayra yig'ib olindi. Ularning metabolizmi triklorosirka kislotasi bilan so'ndiriladi. Ekstraksiya erituvchisi [etanol, suv, efir, piridin va 4,2 N ammoniy gidroksid (15:15:5:1:0,018 v/v)] va 1,2 nmol ichki standart C17 keramid (860517, Avanti qutbli lipid) sifatli foydalaning. Ekstraktning yengil ishqoriy gidrolizini amalga oshirish uchun monometilamin reagentidan [metanol, suv, n-butanol va metilamin eritmasidan (4:3:1:5 v/v)] foydalaning va keyin tuzsizlantirish uchun suv bilan to'yingan n-butanoldan foydalaning. Nihoyat, ekstrakt musbat rejimdagi erituvchida [xloroform/metanol/suv (2:7:1) + 5 mM ammoniy asetat] qayta suspenziya qilindi va massa spektrometriga yuborildi. Sfingolipid molekulalarini aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ko'p reaksiya monitoringi (MRM) amalga oshirildi. TSQ Vantage uchlamchi kvadrupol massa spektrometri (Thermo Fisher Scientific) lipid tahlili uchun robot nanoflow ion manbai Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) bilan jihozlangan. To'qnashuv energiyasi har bir seramid kategoriyasi uchun optimallashtirilgan. MS ma'lumotlari musbat rejimda olingan. Har bir biologik replikatsiya uchun lipid signali uchta mustaqil o'lchovning medianasidir.
(31) da tasvirlanganidek, Gas1-GFP ni ifodalovchi hujayralar (800 × 107) tabiiy immunopresipitatsiyaga uchradi. Tozalangan Gas1-GFP SDS-PAGE yordamida ajratildi va poliviniliden ftorid (PVDF) membranasiga o'tkazildi. Oqsil PVDF ni amid qora rang bilan bo'yash orqali vizualizatsiya qilindi. Gas1-GFP tasmasi PVDF dan kesildi va 5 marta metanol bilan va bir marta suyuq xromatografiya-MS (LC-MS) sinfidagi suv bilan yuvildi. Membrana tasmasini 500 mkl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), bufer va 500 mkl yangi erigan 1 M natriy nitrit aralashmasi bilan 37°C da 3 soat davomida inkubatsiya qilish orqali lipid fraktsiyasi Gas1-GFP dan ajralib chiqadi va lizislanadi. Glyukozamin va inozitol o'rtasida inozin fosfat keramidining ajralib chiqishi (51). Shundan so'ng, membrana tasmasi LC-MS sinfidagi suv bilan to'rt marta yuvildi, xona haroratida quritildi va tahlil qilinmaguncha azot atmosferasida -80°C da saqlandi. Nazorat sifatida har bir tajriba uchun PVDF membranasining bo'sh namunasi ishlatilgan. Keyin Gas1-GFP dan olingan lipid (50) ta'riflanganidek MS yordamida tahlil qilindi. Qisqasi, GPI-lipidni o'z ichiga olgan PVDF tasmalari 75 mkl manfiy mog'or erituvchisida [xloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammoniy asetat] qayta suspenziya qilindi va sfingolipid turlarining elektropurkash ionlanishi (ESI)-MRM/MS tahlilidan o'tkazildi (TSQ Vantage). Bu holda, MS ma'lumotlari manfiy ion rejimida olindi.
Avval aytib o'tilganidek, GPI langarining lipid qismi [3H]-inositol bilan belgilangan GPI-AP dan ajratildi (16). Lipidlar erituvchi tizimi (55:45:10 xloroform-metanol-0,25% KCl) yordamida yupqa qatlamli xromatografiya yordamida ajratildi va FLA-7000 (Fujifilm) yordamida vizualizatsiya qilindi.
Gas1-GFP (600 × 107) ni ifodalovchi hujayralar TNE buferli TNE buferi bilan ikki marta yuvildi va shisha munchoqlar bilan sindirildi, so'ngra hujayra qoldiqlari va shisha munchoqlarni olib tashlash uchun santrifuga qilindi. Keyin supernatant 17000 g da 4°C da 1 soat davomida santrifuga qilindi. Pellet TNE da yuvildi va 0,2% digitalis saponinini o'z ichiga olgan 1 U PI-PLC (Invitrogen) bilan 37°C da 1 soat davomida TNE da inkubatsiya qilindi. Ferment bilan ishlov berilgandan so'ng, membrana 17000 g da 4°C da 1 soat davomida santrifugalash orqali chiqarildi. Gas1-GFP ni immunoprecipitatsiya qilish uchun supernatant GFP-Trap_A (ChromoTek) bilan 4°C da bir kecha davomida inkubatsiya qilindi. SDS-PAGE bilan ajratilgan tozalangan Gas1-GFP Coomassie yorqin ko'kiga bo'yaldi. Gas1-GFP bo'yash tasmasi akveduk atrofidagi kulrangdan uzib tashlandi, so'ngra yodoatsetamid bilan alkillash va ditiotreitol bilan qaytarilishdan so'ng, tripsin bilan gel ichida hazm qilish amalga oshirildi. GPI-glikanlar bilan triptik peptidlar va peptidlarni ekstrakt va quritish. Quritilgan peptid 20 mkl suvda eritildi. Bir porsiya (8 mkl) LC ga yuborildi. Muayyan gradient sharoitida peptidlarni ajratish uchun oktadetsilsilan (ODS) ustuni (Develosil 300ODS-HG-5; ichki diametri 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi prefekturasi, Yaponiya) ishlatilgan. Ko'chma faza A erituvchisi (0,08% chumoli kislotasi) va B erituvchisi (80% asetonitrilda 0,15% chumoli kislotasi) dir. Accela HPLC tizimi (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusets) ustunni A erituvchisi bilan 55 daqiqa davomida 50 μl min-1 oqim tezligida elyut qilish uchun ishlatilgan va keyin B erituvchisining konsentratsiyasi 40% gacha oshirilgan. , Qo'shma Shtatlar). Elyut ESI ion manbaiga doimiy ravishda kiritildi va triptik peptidlar va GPI-glikanli peptidlar LTQ Orbitrap XL (gibrid chiziqli ion tuzog'i-orbitrap massa spektrometri; Thermo Fisher Scientific) yordamida tahlil qilindi. MS sozlamalarida kapillyar manbaning kuchlanishi 4,5 kV ga o'rnatildi va o'tkazuvchi kapillyarning harorati 300°C da saqlandi. Kapillyar kuchlanish va naycha linzasining kuchlanishi mos ravishda 15 V va 50 V ga o'rnatildi. MS ma'lumotlari musbat ion rejimida (rezolyutsiya 60 000; massa aniqligi millionga 10 qism) 300/m/z massa/zaryad nisbati (m/z) 3000 massa diapazonida olingan. MS/MS ma'lumotlari LTQ Orbitrap XL [ma'lumotlar bog'liq bo'lgan dastlabki 3 ta raqam, to'qnashuv natijasida yuzaga kelgan dissotsiatsiya (CID)] dagi ion tuzog'i orqali olinadi.
MD simulyatsiyalari GROMACS (52) dasturi va MARTINI 2 kuch maydoni (53-55) yordamida amalga oshirildi. Keyin CHARMM GUI membrana quruvchisi (56, 57) dioleoilfosfatidilxolin (DOPC) va Cer C18 yoki DOPC va Cer C26 ni o'z ichiga olgan ikki qavatli qatlamni qurish uchun ishlatilgan. Cer C26 ning topologiyasi va koordinatalari sfingozin dumidan qo'shimcha boncuklarni olib tashlash orqali DXCE dan olinadi. Quyida tavsiflangan jarayondan foydalanib, ikki qavatli qatlamni muvozanatlang va uni ishga tushiring, so'ngra Emp24 ni o'z ichiga olgan tizimni yaratish uchun tizimning oxirgi koordinatalaridan foydalaning. Xamirturush Emp24 ning transmembran domeni (173 dan 193 gacha qoldiqlar) vizual MD (VMD) vositasining molekulyar tuzilishi (58) yordamida α-spiral shaklida qurilgan. Keyin, bir-birining ustiga chiqqan lipidlarni olib tashlagandan so'ng, oqsil qo'pol donadorlashtirildi va CHARMM GUI yordamida ikki qavatli qatlamga kiritildi. Yakuniy tizim 1202 DOPC va 302 Cer C26 yoki 1197 DOPC va 295 Cer C18 va Emp24 ni o'z ichiga oladi. Tizimni 0,150 M konsentratsiyaga qadar ionlashtiring. Ikki qatlamli kompozitsiyalar uchun to'rtta mustaqil takrorlash amalga oshirildi.
Lipid ikki qatlami CHARMM GUI jarayoni yordamida muvozanatlanadi, bu jarayon 405 000 bosqichni minimallashtirish va keyin muvozanatlashni o'z ichiga oladi, bunda pozitsiya cheklovlari asta-sekin kamayadi va yo'q qilinadi, vaqt bosqichi esa 0,005 ps dan 0,02 ps gacha oshiriladi. Muvozanatlashgandan so'ng, u 0,02 ps vaqt bosqichi bilan 6 µs hosil qiladi. Emp24 ni kiritgandan so'ng, tizimni minimallashtirish va muvozanatlash uchun xuddi shu CHARMM GUI jarayonidan foydalaning va keyin ishlab chiqarishda 8 soniya davomida bajaring.
Barcha tizimlar uchun muvozanatlash jarayonida bosim Berendsen barostati (59) tomonidan, ishlab chiqarish jarayonida esa bosim Parrinello-Rahman barostati (60) tomonidan boshqariladi. Barcha holatlarda o'rtacha bosim 1 barni tashkil qiladi va yarim izotrop bosimni bog'lash sxemasi qo'llaniladi. Balanslash va ishlab chiqarish jarayonida oqsil, lipid va erituvchi zarrachalarining haroratini mos ravishda bog'lash uchun tezlikni qayta kalibrlash bilan termostat (61) ishlatiladi. Butun operatsiya davomida maqsadli harorat 310K ni tashkil qiladi. Bog'lanmagan o'zaro ta'sir 0,005 bufer bardoshliligi bilan Verlet sxemasidan foydalangan holda juftlashtirish ro'yxatini yaratish orqali hisoblanadi. Kulon hadi reaksiya maydoni va 1,1 nm kesish masofasi yordamida hisoblanadi. Vander Waals hadi 1,1 nm kesish masofasiga ega kesish sxemasidan foydalanadi va Verlet kesish sxemasi potentsial siljish uchun ishlatiladi (62).
VMD yordamida DOPC fosfat boncuklari yoki seramid AM1 boncuklari va oqsil orasidagi kesish to'lqin uzunligi 0,7 nm ni tashkil qiladi va oqsil bilan o'zaro ta'sir qiluvchi lipidlar soni hisoblanadi. Quyidagi formulaga muvofiq, (63) dagi kabi kamayib ketish-boyitish (DE) koeffitsientini hisoblang: DE koeffitsienti = (oqsildagi umumiy lipidlar miqdori 0,7) oqsilda 0,7 (umumiy lipidlardagi Cer miqdori)
Hisobot qilingan qiymat o'rtacha qiymat sifatida olinadi va xato satrlari SE ning to'rtta mustaqil nusxasi hisoblanadi. DE omilining statistik ahamiyati t testi [(o'rtacha DE-faktor-1)/SE] yordamida hisoblanadi. Bir dumli taqsimotdan P qiymatini hisoblang.
GROMACS vositasi izning oxirgi 250 ns ichida Emp24 ni o'z ichiga olgan tizimning 2D lateral zichlik xaritasini hisoblash uchun ishlatilgan. Keramidning boyitish/kamaytirish xaritasini olish uchun Cer zichlik xaritasi Cer va DOPC xaritasining yig'indisiga bo'linadi va keyin tanadagi Cer konsentratsiyasiga bo'linadi. Xuddi shu rangli xarita shkalasi qo'llaniladi.
Ushbu maqola uchun qo'shimcha materiallar uchun http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ga qarang.
Bu Creative Commons Attribution-Notijorat Litsenziyasi shartlari asosida tarqatiladigan ochiq kirish maqolasi bo'lib, u har qanday vositada foydalanish, tarqatish va ko'paytirishga imkon beradi, agar oxirgi foydalanish tijorat maqsadlarida foydalanilmasa va asl asar to'g'ri bo'lsa.
Eslatma: Sizdan faqat elektron pochta manzilingizni taqdim etishingizni so'raymiz, shunda sahifaga tavsiya qilgan odam siz elektron pochtani ko'rishini xohlayotganingizni va u spam emasligini biladi. Biz hech qanday elektron pochta manzillarini yozib olmaymiz.
Bu savol sizning tashrif buyuruvchi ekanligingizni tekshirish va avtomatik spam yuborishning oldini olish uchun ishlatiladi.
Sofiya Rodriges-Gallardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alexandro Kortez · Gomes (Alejandro Kortes-Gomes), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeriya Zoni (Valeriya Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Mario Perez (L) Lopes), Mixo Vaga (Mixo Vaga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prou ​​Akira, Stefano Fanni, Akixiko Nakano, Manuel Muniz
3D yuqori aniqlikdagi real vaqt rejimida tasvirlash selektiv chiqish joylarida oqsillarni saralash uchun keramid zanjiri uzunligining ahamiyatini ochib beradi.
Sofiya Rodriges-Gallardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alexandro Kortez · Gomes (Alejandro Kortes-Gomes), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeriya Zoni (Valeriya Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Mario Perez (L) Lopes), Mixo Vaga (Mixo Vaga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prou ​​Akira, Stefano Fanni, Akixiko Nakano, Manuel Muniz
3D yuqori aniqlikdagi real vaqt rejimida tasvirlash selektiv chiqish joylarida oqsillarni saralash uchun keramid zanjiri uzunligining ahamiyatini ochib beradi.
©2020 Amerika fan taraqqiyoti assotsiatsiyasi. barcha huquqlar himoyalangan. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef va COUNTER hamkori hisoblanadi. Science Advances ISSN 2375-2548.