Biz ilgari jigar fibrozi bilan og'rigan bemorlarda ichakdan olingan triptofan metaboliti indol-3-propion kislotasining (IPA) zardobdagi darajasi pastroq ekanligi haqida xabar bergan edik. Ushbu tadqiqotda biz semiz jigarlarda transkriptom va DNK metilomasini zardob IPA darajasi bilan bog'liq holda, shuningdek, in vitro sharoitida jigar stellat hujayralarining (HSC) fenotipik inaktivatsiyasini qo'zg'atishdagi IPA rolini o'rganib chiqdik.
Tadqiqotga Kuopio Bariatrik Jarrohlik Markazida (KOBS) bariatrik jarrohlik amaliyotini o'tkazgan 2-toifa diabet (2-toifa diabet) bo'lmagan 116 semiz bemor (yoshi 46,8 ± 9,3 yosh; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) kiritilgan. Qon aylanish IPA darajalari suyuq xromatografiya-massa spektrometriyasi (LC-MS) yordamida o'lchandi, jigar transkriptom tahlili umumiy RNK ketma-ketligi yordamida va DNK metilatsiyasi tahlili Infinium HumanMethylation450 BeadChip yordamida amalga oshirildi. In vitro tajribalar uchun inson jigar stellat hujayralari (LX-2) ishlatilgan.
Zardobdagi IPA darajalari jigarda apoptoz, mitofagik va uzoq umr ko'rish yo'llarida ishtirok etuvchi genlarning ifodalanishi bilan bog'liq edi. AKT serin/treonin kinaz 1 (AKT1) geni jigar transkripti va DNK metillanish profillarida eng ko'p uchraydigan va dominant o'zaro ta'sir qiluvchi gen edi. IPA bilan davolash fibroz, apoptoz va LX-2 hujayralarining omon qolishini tartibga soluvchi genlarning ifodasini modulyatsiya qilish orqali apoptozni, mitoxondrial nafas olishning pasayishini va hujayra morfologiyasi va mitoxondrial dinamikasini o'zgartirdi.
Umuman olganda, ushbu ma'lumotlar IPA potentsial terapevtik ta'sirga ega ekanligini va apoptozni keltirib chiqarishi va HSC fenotipini faol bo'lmagan holatga o'tkazishi mumkinligini, shu bilan HSC faollashuvi va mitoxondrial metabolizmga xalaqit berish orqali jigar fibrozini inhibe qilish imkoniyatini kengaytirishini qo'llab-quvvatlaydi.
Semizlik va metabolik sindromning tarqalishi metabolik jihatdan bog'liq yog'li jigar kasalligi (MASLD) holatlarining ko'payishi bilan bog'liq; kasallik umumiy populyatsiyaning 25% dan 30% gacha ta'sir qiladi [1]. MASLD etiologiyasining asosiy oqibati jigar fibrozi bo'lib, bu tolali hujayradan tashqari matritsaning (ECM) uzluksiz to'planishi bilan tavsiflangan dinamik jarayondir [2]. Jigar fibrozida ishtirok etadigan asosiy hujayralar jigar yulduzsimon hujayralari (HSC) bo'lib, ular to'rtta ma'lum fenotipni namoyish etadi: tinch, faollashtirilgan, inaktiv va qari [3, 4]. HSClar faollashishi va tinch shakldan yuqori energiya talab qiladigan proliferativ fibroblastga o'xshash hujayralarga transdifferentsiatsiyalanishi mumkin, bunda α-silliq mushak aktin (α-SMA) va I tip kollagen (Col-I) ifodasi oshadi [5, 6]. Jigar fibrozining tiklanishi paytida faollashtirilgan HSClar apoptoz yoki inaktivatsiya orqali yo'q qilinadi. Bu jarayonlar fibrogen genlarning pastga regulyatsiyasi va prosurvival genlarning modulyatsiyasi (masalan, NF-κB va PI3K/Akt signalizatsiya yo'llari) [7, 8], shuningdek, mitoxondrial dinamika va funksiyadagi o'zgarishlarni o'z ichiga oladi [9].
Ichakda ishlab chiqariladigan triptofan metaboliti indol-3-propion kislotasining (IPA) sarum darajasi MASLD kabi inson metabolik kasalliklarida kamayganligi aniqlandi [10-13]. IPA parhez tolasini iste'mol qilish bilan bog'liq, antioksidant va yallig'lanishga qarshi ta'siri bilan mashhur va parhez keltirib chiqaradigan alkogolsiz steatogepatit (NASH) fenotipini in vivo va in vitro sharoitida susaytiradi [11-14]. Ba'zi dalillar bizning avvalgi tadqiqotimizdan olingan bo'lib, ular Kuopio Bariatrik Jarrohlik Tadqiqotida (KOBS) jigar fibrozi bo'lmagan semiz bemorlarga qaraganda jigar fibrozi bilan og'rigan bemorlarda sarum IPA darajasi pastroq ekanligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, biz IPA bilan davolash inson jigar yulduzsimon hujayrasi (LX-2) modelida hujayra adgeziyasi, hujayra migratsiyasi va gematopoetik ildiz hujayralari faollashuvining klassik markerlari bo'lgan va potentsial gepatoprotektiv metabolit bo'lgan genlarning ifodasini kamaytirishi mumkinligini ko'rsatdik [15]. Biroq, IPA qanday qilib HSC apoptozi va mitoxondrial bioenergetikani faollashtirish orqali jigar fibrozining regressiyasini keltirib chiqarishi noma'lumligicha qolmoqda.
Bu yerda biz zardob IPA semiz, ammo 2-toifa diabet (KOBS) bo'lmagan odamlarning jigarida apoptoz, mitofagiya va uzoq umr ko'rish yo'llariga boy genlarning ifodalanishi bilan bog'liqligini ko'rsatamiz. Bundan tashqari, biz IPA inaktivatsiya yo'li orqali faollashtirilgan gematopoetik ildiz hujayralarining (HSC) tozalanishi va parchalanishini keltirib chiqarishi mumkinligini aniqladik. Ushbu natijalar IPA uchun yangi rolni ochib beradi, bu uni jigar fibrozining regressiyasini rag'batlantirish uchun potentsial terapevtik nishonga aylantiradi.
KOBS kohortasida o'tkazilgan avvalgi tadqiqot shuni ko'rsatdiki, jigar fibrozi bilan og'rigan bemorlarda jigar fibrozi bo'lmagan bemorlarga nisbatan qon aylanish IPA darajasi pastroq edi [15]. 2-toifa diabetning potentsial chalkashtiruvchi ta'sirini istisno qilish uchun biz davom etayotgan KOBS tadqiqotidan tadqiqot populyatsiyasi sifatida 2-toifa diabetsiz 116 semiz bemorni (o'rtacha yosh ± SD: 46,8 ± 9,3 yosh; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (1-jadval) jalb qildik [16]. Barcha ishtirokchilar yozma ravishda xabardor qilingan rozilik berishdi va tadqiqot protokoli Xelsinki deklaratsiyasiga (54/2005, 104/2008 va 27/2010) muvofiq Shimoliy Savo okrugi kasalxonasining axloq qo'mitasi tomonidan tasdiqlandi.
Jigar biopsiyasi namunalari bariatrik jarrohlik paytida olindi va tajribali patologlar tomonidan ilgari tasvirlangan mezonlarga muvofiq gistologik jihatdan baholandi [17, 18]. Baholash mezonlari S1 qo'shimcha jadvalida umumlashtirilgan va ilgari tasvirlangan [19].
Ro'za zardobi namunalari metabolomika tahlili uchun maqsadsiz suyuq xromatografiya-massa spektrometriyasi (LC-MS) yordamida tahlil qilindi (n = 116). Namunalar avvalroq tasvirlanganidek UHPLC-qTOF-MS tizimi (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germaniya) yordamida tahlil qilindi19. Izopropil spirtini (IPA) aniqlash saqlash vaqti va MS/MS spektrini sof standartlar bilan taqqoslashga asoslangan edi. IPA signal intensivligi (cho'qqi maydoni) barcha keyingi tahlillarda hisobga olingan [20].
Jigarning butun RNK ketma-ketligi Illumina HiSeq 2500 yordamida amalga oshirildi va ma'lumotlar avval tasvirlanganidek oldindan qayta ishlandi [19, 21, 22]. Biz MitoMiner 4.0 ma'lumotlar bazasidan tanlangan 1957 ta gen yordamida mitoxondrial funktsiya/biogenezga ta'sir qiluvchi transkriptlarning maqsadli differentsial ekspressiya tahlilini o'tkazdik [23]. Jigar DNK metilatsiyasi tahlili avval tasvirlangan metodologiya yordamida Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San-Diego, Kaliforniya, AQSh) yordamida amalga oshirildi [24, 25].
Inson jigarining yulduzsimon hujayralari (LX-2) professor Stefano Romeo tomonidan taqdim etildi va DMEM/F12 muhitida (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) yetishtirildi va saqlandi. IPA ning ishchi dozasini tanlash uchun LX-2 hujayralari DMEM/F12 muhitida 24 soat davomida turli konsentratsiyali IPA (10 μM, 100 μM va 1 mM; Sigma, 220027) bilan ishlov berildi. Bundan tashqari, IPA ning HSC ni inaktivatsiya qilish qobiliyatini o'rganish uchun LX-2 hujayralari zardobsiz muhitda 24 soat davomida 5 ng/ml TGF-β1 (R&D tizimlari, 240-B-002/CF) va 1 mM IPA bilan birgalikda ishlov berildi. Tegishli vosita boshqaruv elementlari uchun TGF-β1 bilan davolash uchun 0,1% BSA saqlovchi 4 nM HCL va IPA bilan davolash uchun 0,05% DMSO ishlatilgan va ikkalasi ham kombinatsiyalangan davolash uchun birgalikda ishlatilgan.
Apoptoz ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq FITC Annexin V Apoptozni aniqlash to'plami (7-AAD bilan) (Biolegend, San-Diego, CA, AQSH, Cat# 640922) yordamida baholandi. Qisqacha aytganda, LX-2 (1 × 105 hujayra/quduq) 12 quduqli plastinkalarda bir kecha davomida o'stirildi va keyin IPA yoki IPA va TGF-β1 ning bir nechta dozalari bilan ishlov berildi. Ertasi kuni suzuvchi va yopishqoq hujayralar to'plandi, tripsinizatsiya qilindi, PBS bilan yuvildi, Annexin V bog'lash buferida qayta suspenziya qilindi va FITC-Annexin V va 7-AAD bilan 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.
Tirik hujayralardagi mitoxondriyalar Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) yordamida oksidlovchi faollik uchun bo'yalgan. MTR tahlillari uchun LX-2 hujayralari IPA va TGF-β1 bilan teng zichlikda inkubatsiya qilingan. 24 soatdan so'ng, tirik hujayralar tripsinlangan, PBS bilan yuvilgan va keyin avval tasvirlanganidek [26], 37 °C da 20 daqiqa davomida zardobsiz muhitda 100 μM MTR bilan inkubatsiya qilingan. Tirik hujayralar morfologiyasini tahlil qilish uchun hujayra hajmi va sitoplazmatik murakkabligi mos ravishda oldinga sochilish (FSC) va yon sochilish (SSC) parametrlari yordamida tahlil qilingan.
Barcha ma'lumotlar (30 000 ta hodisa) NovoCyte Quanteon (Agilent) yordamida to'plandi va NovoExpress® 1.4.1 yoki FlowJo V.10 dasturi yordamida tahlil qilindi.
Kislorod iste'moli darajasi (OCR) va hujayradan tashqari kislotalanish darajasi (ECAR) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Seahorse XF Cell Mito Stress bilan jihozlangan Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) yordamida real vaqt rejimida o'lchandi. Qisqacha aytganda, 2 × 104 LX-2 hujayralari/quduq XF96 hujayra madaniyati plitalariga ekildi. Bir kechada inkubatsiyadan so'ng, hujayralar izopropanol (IPA) va TGF-β1 (Qo'shimcha usullar 1) bilan ishlov berildi. Ma'lumotlar tahlili Seahorse XF Cell Energy Fenotip Test Report Generatorini o'z ichiga olgan Seahorse XF Wave dasturi yordamida amalga oshirildi. Shundan kelib chiqib, Bioenergetik Sog'liqni Saqlash Indeksi (BHI) hisoblab chiqildi [27].
Umumiy RNK kDNKga transkripsiya qilindi. Muayyan usullar uchun [15] ma'lumotnomasiga qarang. Insonning 60S ribosomal kislotali oqsili P0 (RPLP0) va siklofilin A1 (PPIA) mRNK darajalari konstitutiv gen nazorati sifatida ishlatilgan. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR tizimi (Thermo Fisher, Landsmeer, Niderlandiya) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) yoki Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) bilan ishlatilgan va nisbiy gen ekspressiyasi katlami qiyosiy Ct qiymati sikl parametrlari (ΔΔCt) va ∆∆Ct usuli yordamida hisoblangan. Primerlar haqida batafsil ma'lumot S2 va S3 qo'shimcha jadvallarida keltirilgan.
Yadro DNKsi (ncDNA) va mitoxondrial DNK (mtDNA) avvalroq [28] tasvirlanganidek, DNeasy qon va to'qima to'plami (Qiagen) yordamida ajratib olindi. MtDNAning nisbiy miqdori har bir maqsadli mtDNA mintaqasining uchta yadro DNK mintaqasining (mtDNA/ncDNA) geometrik o'rtacha qiymatiga nisbatini hisoblash yo'li bilan hisoblab chiqildi, bu Qo'shimcha usullar 2 da batafsil bayon etilgan. MtDNA va ncDNA uchun primerlarning tafsilotlari Qo'shimcha S4 jadvalida keltirilgan.
Tirik hujayralar hujayralararo va hujayra ichidagi mitoxondrial tarmoqlarni vizualizatsiya qilish uchun Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) bilan bo'yalgan. LX-2 hujayralari (1 × 104 hujayra/quduq) shisha slaydlarda mos keladigan shisha taglikli madaniyat plastinkalarida (Ibidi GmbH, Martinsried, Germaniya) kultivatsiya qilingan. 24 soatdan so'ng, tirik LX-2 hujayralari 37 °C da 20 daqiqa davomida 100 μM MTR bilan inkubatsiya qilingan va hujayra yadrolari avval tasvirlanganidek DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) bilan bo'yalgan [29]. Mitoxondrial tarmoqlar 37 °C da 5% CO2 bilan namlangan atmosferada 63 × NA 1.3 obyektiv yordamida Zeiss LSM 800 konfokal moduli bilan jihozlangan Zeiss Axio Observer teskari mikroskopi (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germaniya) yordamida vizualizatsiya qilingan. Biz har bir namuna turi uchun o'nta Z-seriyali tasvirlarni oldik. Har bir Z-seriya 30 ta bo'limdan iborat bo'lib, ularning har biri qalinligi 9,86 mkm. Har bir namuna uchun ZEN 2009 dasturi (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germaniya) yordamida o'nta turli ko'rish maydonlarining tasvirlari olindi va mitoxondrial morfologiya tahlili 3-qo'shimcha usullarda batafsil bayon etilgan parametrlarga muvofiq ImageJ dasturi (v1.54d) [30, 31] yordamida amalga oshirildi.
Hujayralar 0,1 M fosfat buferida 2% glutaraldegid bilan fiksatsiya qilindi, so'ngra 1% osmiy tetroksid eritmasi (Sigma Aldrich, MO, AQSh) bilan fiksatsiya qilindi, aseton bilan asta-sekin quritildi (Merck, Darmstadt, Germaniya) va nihoyat epoksi qatroniga joylashtirildi. Ultra yupqa kesmalar tayyorlandi va 1% uranil asetat (Merck, Darmstadt, Germaniya) va 1% qo'rg'oshin sitrat (Merck, Darmstadt, Germaniya) bilan bo'yaldi. Ultrastrukturaviy tasvirlar 80 kV tezlashtiruvchi kuchlanishda JEM 2100F EXII uzatish elektron mikroskopi (JEOL Ltd, Tokio, Yaponiya) yordamida olindi.
24 soat davomida IPA bilan davolangan LX-2 hujayralarining morfologiyasi Zeiss teskari yorug'lik mikroskopi (Zeiss Axio Vert.A1 va AxioCam MRm, Jena, Germaniya) yordamida 50 marta kattalashtirishda fazali kontrastli mikroskopiya yordamida tahlil qilindi.
Klinik ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish yoki mediana (kvartillararo diapazon: IQR) sifatida ifodalangan. Uchta tadqiqot guruhlari o'rtasidagi farqlarni taqqoslash uchun bir tomonlama dispersiya tahlili (uzluksiz o'zgaruvchilar) yoki χ² testi (kategorik o'zgaruvchilar) ishlatilgan. Ko'p martalik testlarni tuzatish uchun noto'g'ri musbat ko'rsatkich (FDR) ishlatilgan va FDR < 0,05 bo'lgan genlar statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblangan. CpG DNK metilatsiyasini IPA signal intensivligi bilan bog'lash uchun Spearman korrelyatsiyasi tahlili qo'llanilgan, nominal p qiymatlari (p < 0,05) xabar qilingan.
Yo'l tahlili 268 ta transkript (nominal p <0.01), mitoxondriya bilan bog'liq 119 ta transkript (nominal p <0.05) va qon aylanishdagi zardob IPA darajalari bilan bog'liq bo'lgan 3093 ta jigar transkriptidan 4350 ta CpG uchun veb-asosidagi genlar to'plamini tahlil qilish vositasi (WebGestalt) yordamida amalga oshirildi. Bepul mavjud bo'lgan Venny DB (2.1.0 versiyasi) vositasi bir-biriga mos keladigan genlarni topish uchun, StringDB (11.5 versiyasi) esa oqsil-oqsil o'zaro ta'sirini vizualizatsiya qilish uchun ishlatilgan.
LX-2 tajribasi uchun namunalar D'Agostino-Pearson testi yordamida normallik uchun sinovdan o'tkazildi. Ma'lumotlar kamida uchta biologik replikatsiyadan olindi va Bonferroni post-hoc testi bilan bir tomonlama ANOVA ga duchor qilindi. 0,05 dan kam p-qiymati statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblandi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida taqdim etilgan va har bir rasmda tajribalar soni ko'rsatilgan. Barcha tahlillar va grafiklar Windows uchun GraphPad Prism 8 statistik dasturi (GraphPad Software Inc., 8.4.3 versiyasi, San-Diego, AQSh) yordamida amalga oshirildi.
Birinchidan, biz zardob IPA darajasining jigar, butun tana va mitoxondrial transkriptlar bilan bog'liqligini tekshirdik. Umumiy transkript profilida zardob IPA darajasi bilan bog'liq eng kuchli gen MAPKAPK3 edi (FDR = 0.0077; mitogen bilan faollashtirilgan protein kinaza bilan faollashtirilgan protein kinaza 3); mitoxondrial transkript profilida eng kuchli bog'liq gen AKT1 edi (FDR = 0.7621; AKT serin/treonin kinaza 1) (Qo'shimcha fayl 1 va Qo'shimcha fayl 2).
Keyin biz global transkriptlarni (n = 268; p < 0.01) va mitoxondriyalar bilan bog'liq transkriptlarni (n = 119; p < 0.05) tahlil qildik, natijada apoptozni eng muhim kanonik yo'l sifatida aniqladik (p = 0.0089). Zardob IPA darajalari bilan bog'liq mitoxondrial transkriptlar uchun biz apoptozga (FDR = 0.00001), mitofagiyaga (FDR = 0.00029) va TNF signalizatsiya yo'llariga (FDR = 0.000006) e'tibor qaratdik (1A-rasm, 2-jadval va 1A-B qo'shimcha rasmlar).
Inson jigarida global, mitoxondriya bilan bog'liq transkriptlar va DNK metillanishining sarum IPA darajalari bilan bog'liq holda bir-birining ustiga chiqadigan tahlili. A sarum IPA darajalari bilan bog'liq 3092 CpG joylariga xaritalangan 268 ta global transkript, 119 ta mitoxondriya bilan bog'liq transkript va DNK metillangan transkriptlarni ifodalaydi (global transkriptlar va metillangan DNK uchun p qiymatlari < 0,01 va mitoxondrial transkriptlar uchun p qiymatlari < 0,05). Asosiy bir-birining ustiga chiqadigan transkriptlar o'rtada ko'rsatilgan (AKT1 va YKT6). B Eng yuqori o'zaro ta'sir balli (0,900) bo'lgan 13 ta genning boshqa genlar bilan o'zaro ta'sir xaritasi StringDB onlayn vositasi yordamida sarum IPA darajalari bilan sezilarli darajada bog'liq bo'lgan 56 ta bir-birining ustiga chiqadigan genlardan (qora chiziq mintaqasi) tuzilgan. Yashil: Gen Ontologiyasi (GO) hujayra komponentiga xaritalangan genlar: mitoxondriyalar (GO:0005739). AKT1 - bu ma'lumotlarga (matn qidirish, tajribalar, ma'lumotlar bazalari va birgalikda ifodalash asosida) asoslangan boshqa oqsillar bilan o'zaro ta'sirlar bo'yicha eng yuqori ball (0,900) ga ega oqsil. Tarmoq tugunlari oqsillarni, qirralari esa oqsillar orasidagi bog'lanishlarni ifodalaydi.
Ichak mikrobiota metabolitlari DNK metillanishi orqali epigenetik tarkibni tartibga solishi mumkinligi sababli [32], biz zardob IPA darajalari jigar DNK metillanishi bilan bog'liqligini tekshirdik. Biz zardob IPA darajalari bilan bog'liq ikkita asosiy metillanish joylari prolin-seringa boy 3-mintaqa (C19orf55) va issiqlik zarbasi oqsili oilasi B (kichik) a'zosi 6 (HSPB6) yaqinida ekanligini aniqladik (qo'shimcha fayl 3). 4350 CpG ning DNK metillanishi (p < 0,01) zardob IPA darajalari bilan o'zaro bog'liq edi va uzoq umr ko'rishni tartibga solish yo'llari bilan boyitilgan (p = 0,006) (1A-rasm, 2-jadval va qo'shimcha 1C-rasm).
Inson jigarida zardob IPA darajalari, global transkriptlar, mitoxondriya bilan bog'liq transkriptlar va DNK metilatsiyasi o'rtasidagi bog'liqlikning biologik mexanizmlarini tushunish uchun biz oldingi yo'l tahlilida aniqlangan genlarning ustma-ust tushish tahlilini o'tkazdik (1A-rasm). 56 ta ustma-ust tushgan genlarning yo'lni boyitish tahlili natijalari (1A-rasmdagi qora chiziq ichida) apoptoz yo'li (p = 0.00029) uchta tahlil uchun umumiy bo'lgan ikkita genni ajratib ko'rsatdi: Venn diagrammasida ko'rsatilganidek (2-qo'shimcha rasm va 1A-rasm). Qizig'i shundaki, biz AKT1 (cg19831386) va YKT6 (cg24161647) zardob IPA darajalari bilan ijobiy bog'liqligini aniqladik (3-qo'shimcha fayl). Gen mahsulotlari orasidagi potentsial oqsil o'zaro ta'sirini aniqlash uchun biz kirish sifatida 56 ta ustma-ust tushgan genlar orasidan eng yuqori umumiy mintaqa balli (0.900) bo'lgan 13 ta genni tanladik va o'zaro ta'sir xaritasini tuzdik. Ishonch darajasiga (marjinal ishonch) ko'ra, eng yuqori ball (0,900) ga ega bo'lgan AKT1 geni eng yuqori o'rinda edi (1B-rasm).
Yo'l tahliliga asoslanib, biz apoptoz asosiy yo'l ekanligini aniqladik, shuning uchun biz IPA bilan davolash in vitro HSClarning apoptoziga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirdik. Biz ilgari IPA ning turli dozalari (10 μM, 100 μM va 1 mM) LX-2 hujayralari uchun toksik emasligini ko'rsatdik [15]. Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatdiki, 10 μM va 100 μM da IPA bilan davolash yashovchan va nekrotik hujayralar sonini ko'paytirdi. Biroq, nazorat guruhi bilan solishtirganda, hujayra yashovchanligi 1 mM IPA konsentratsiyasida pasaygan, hujayra nekrozi darajasi esa o'zgarishsiz qolgan (2A, B-rasm). Keyin, LX-2 hujayralarida apoptozni qo'zg'atish uchun optimal konsentratsiyani topish uchun biz 24 soat davomida 10 μM, 100 μM va 1 mM IPA ni sinab ko'rdik (2A-E-rasm va qo'shimcha 3A-B-rasm). Qizig'i shundaki, IPA 10 μM va 100 μM apoptoz tezligini (%) kamaytirdi, ammo IPA 1 mM nazorat guruhiga nisbatan kech apoptoz va apoptoz tezligini (%) oshirdi va shuning uchun keyingi tajribalar uchun tanlandi (2A–D rasmlar).
IPA LX-2 hujayralarining apoptozini keltirib chiqaradi. Oqim sitometriyasi yordamida apoptoz tezligi va hujayra morfologiyasini aniqlash uchun Annexin V va 7-AAD ikki marta bo'yash usuli qo'llanildi. BA hujayralari 24 soat davomida 10 μM, 100 μM va 1 mM IPA bilan yoki 24 soat davomida zardobsiz muhitda F–H TGF-β1 (5 ng/ml) va 1 mM IPA bilan inkubatsiya qilindi. A: tirik hujayralar (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotik hujayralar (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: erta (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: kech (Annexin V+/7AAD.+); E, H: apoptoz tezligidagi umumiy erta va kech apoptoz hujayralarining foizi (%). Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ifodalanadi, n = 3 ta mustaqil tajriba. Statistik taqqoslashlar Bonferroni post hoc testi bilan bir tomonlama ANOVA yordamida amalga oshirildi. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Avval ko'rsatib o'tganimizdek, 5 ng/ml TGF-β1 klassik marker genlarining ifodasini oshirish orqali HSC faollashuvini qo'zg'atishi mumkin [15]. LX-2 hujayralari 5 ng/ml TGF-β1 va 1 mM IPA bilan birgalikda davolandi (2E–H-rasm). TGF-β1 bilan davolash apoptoz tezligini o'zgartirmadi, ammo IPA bilan birgalikda davolash TGF-β1 bilan davolashga nisbatan kech apoptoz va apoptoz tezligini (%) oshirdi (2E–H-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, 1 mM IPA TGF-β1 induksiyasidan mustaqil ravishda LX-2 hujayralarida apoptozni kuchaytirishi mumkin.
Biz LX-2 hujayralarida IPA ning mitoxondrial nafas olishga ta'sirini yanada o'rganib chiqdik. Natijalar shuni ko'rsatdiki, 1 mM IPA kislorod iste'moli darajasi (OCR) parametrlarini pasaytirdi: mitoxondrial bo'lmagan nafas olish, bazal va maksimal nafas olish, proton oqishi va ATP ishlab chiqarish nazorat guruhiga nisbatan (3A, B-rasm), bioenergetik sog'liq indeksi (BHI) esa o'zgarmadi.
IPA LX-2 hujayralarida mitoxondrial nafas olishni kamaytiradi. Mitoxondrial nafas olish egri chizig'i (OCR) mitoxondrial nafas olish parametrlari (mitoxondrial bo'lmagan nafas olish, bazal nafas olish, maksimal nafas olish, proton oqishi, ATP hosil bo'lishi, SRC va BHI) sifatida taqdim etiladi. A va B hujayralari mos ravishda 10 μM, 100 μM va 1 mM IPA bilan 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. C va D hujayralari mos ravishda zardobsiz muhitda TGF-β1 (5 ng/ml) va 1 mM IPA bilan 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. Barcha o'lchovlar CyQuant to'plami yordamida DNK tarkibiga normallashtirildi. BHI: bioenergetik sog'liq indeksi; SRC: nafas olish zaxirasi hajmi; OCR: kislorod iste'moli darajasi. Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida taqdim etiladi, n = 5 ta mustaqil tajriba. Statistik taqqoslashlar bir tomonlama ANOVA va Bonferroni post hoc testi yordamida amalga oshirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; va ***p < 0,001
IPA ning TGF-β1 bilan faollashtirilgan LX-2 hujayralarining bioenergetik profiliga ta'sirini yanada kengroq tushunish uchun biz OCR orqali mitoxondriyal oksidlovchi fosforillanishni tahlil qildik (3C, D-rasm). Natijalar shuni ko'rsatdiki, TGF-β1 bilan davolash nazorat guruhi bilan solishtirganda maksimal nafas olish, nafas olish zahirasining hajmi (SRC) va BHI ni kamaytirishi mumkin (3C, D-rasm). Bundan tashqari, kombinatsiyalangan davolash bazal nafas olishni, proton oqishi va ATP ishlab chiqarishni kamaytirdi, ammo SRC va BHI TGF-β1 bilan davolanganlarga qaraganda ancha yuqori edi (3C, D-rasm).
Shuningdek, biz Seahorse dasturi tomonidan taqdim etilgan "Hujayra energiyasi fenotipi testi"ni o'tkazdik (4A-D qo'shimcha rasm). 3B qo'shimcha rasmda ko'rsatilgandek, TGF-β1 bilan davolashdan keyin OCR va ECAR metabolik potentsiallari pasaygan, ammo nazorat guruhiga nisbatan kombinatsiyalangan va IPA davolash guruhlarida hech qanday farq kuzatilmadi. Bundan tashqari, nazorat guruhiga nisbatan kombinatsiyalangan va IPA bilan davolashdan keyin OCR ning bazal va stress darajalari pasaygan (4C qo'shimcha rasm). Qizig'i shundaki, shunga o'xshash naqsh kombinatsiyalangan terapiya bilan ham kuzatildi, bu yerda TGF-β1 bilan davolashga nisbatan ECAR ning bazal va stress darajalarida hech qanday o'zgarish kuzatilmadi (4C qo'shimcha rasm). HSClarda mitoxondriyal oksidlovchi fosforillanishning pasayishi va kombinatsiyalangan davolashning TGF-β1 bilan davolashdan keyin SCR va BHI ni tiklash qobiliyati metabolik potentsialni o'zgartirmadi (OCR va ECAR). Umuman olganda, bu natijalar IPA HSClarda bioenergetikani kamaytirishi mumkinligini ko'rsatadi, bu IPA HSC fenotipini inaktivatsiyaga yo'naltiradigan pastroq energetik profilni keltirib chiqarishi mumkinligini ko'rsatadi (Qo'shimcha 4D-rasm).
IPA ning mitoxondrial dinamikaga ta'siri mitoxondrial morfologiya va tarmoq ulanishlarining uch o'lchovli miqdorini aniqlash, shuningdek, MTR bo'yash yordamida o'rganildi (4-rasm va 5-qo'shimcha rasm). 4-rasmda ko'rsatilganidek, nazorat guruhi bilan solishtirganda, TGF-β1 bilan davolash o'rtacha sirt maydonini, shoxlar sonini, shoxlarning umumiy uzunligini va shoxlarning birikish sonini kamaytirdi (4A va B-rasm) va mitoxondriallarning ulushini sferikdan oraliq morfologiyaga o'zgartirdi (4C-rasm). Faqat IPA bilan davolash o'rtacha mitoxondrial hajmni kamaytirdi va mitoxondriallarning ulushini nazorat guruhi bilan solishtirganda sferikdan oraliq morfologiyaga o'zgartirdi (4A-rasm). Aksincha, mitoxondrial membrana potentsialiga bog'liq MTR tomonidan baholangan sferiklik, o'rtacha shox uzunligi va mitoxondrial faollik (4A va E-rasm) o'zgarishsiz qoldi va bu parametrlar guruhlar o'rtasida farq qilmadi. Birgalikda, bu natijalar TGF-β1 va IPA bilan davolash tirik LX-2 hujayralarida mitoxondrial shakl va o'lchamni, shuningdek, tarmoq murakkabligini modulyatsiya qilishini ko'rsatadi.
IPA LX-2 hujayralarida mitoxondrial dinamikani va mitoxondrial DNK miqdorini o'zgartiradi. A. TGF-β1 (5 ng/ml) va 1 mM IPA bilan 24 soat davomida zardobsiz muhitda inkubatsiya qilingan tirik LX-2 hujayralarining vakillik konfokal tasvirlari, Mitotracker™ Red CMXRos bilan bo'yalgan mitoxondrial tarmoqlarni va DAPI bilan ko'k rangga bo'yalgan yadrolarni ko'rsatadi. Barcha ma'lumotlar har bir guruh uchun kamida 15 ta tasvirni o'z ichiga olgan. Biz har bir namunaviy tur uchun 10 ta Z-stack tasvirini oldik. Har bir Z o'qi ketma-ketligi 30 ta bo'lakni o'z ichiga olgan bo'lib, ularning har biri qalinligi 9,86 mkm. Masshtab chizig'i: 10 mkm. B. Tasvirga moslashuvchan chegarani qo'llash orqali aniqlangan vakillik obyektlari (faqat mitoxondriallar uchun). Har bir guruhdagi barcha hujayralar uchun miqdoriy tahlil va mitoxondrial morfologik tarmoq ulanishlarini taqqoslash amalga oshirildi. C. Mitoxondrial shakl nisbatlarining chastotasi. 0 ga yaqin qiymatlar sharsimon shakllarni, 1 ga yaqin qiymatlar esa filamentli shakllarni ko'rsatadi. D Mitoxondrial DNK (mtDNK) tarkibi Materiallar va usullar bo'limida tasvirlanganidek aniqlandi. E Mitotracker™ Red CMXRos tahlili Materiallar va usullar bo'limida tasvirlanganidek oqim sitometriyasi (30 000 ta hodisa) yordamida amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida taqdim etilgan, n = 3 ta mustaqil tajriba. Statistik taqqoslashlar bir tomonlama ANOVA va Bonferroni post hoc testi yordamida amalga oshirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Keyin biz LX-2 hujayralaridagi mtDNK miqdorini mitoxondriyal sonning ko'rsatkichi sifatida tahlil qildik. Nazorat guruhi bilan solishtirganda, TGF-β1 bilan davolangan guruhda mtDNK miqdori oshdi (4D-rasm). TGF-β1 bilan davolangan guruh bilan solishtirganda, kombinatsiyalangan davolash guruhida mtDNK miqdori kamaydi (4D-rasm), bu IPA mtDNK miqdorini va ehtimol mitoxondriyal sonni, shuningdek, mitoxondriyal nafas olishni kamaytirishi mumkinligini ko'rsatadi (3C-rasm). Bundan tashqari, IPA kombinatsiyalangan davolashda mtDNK miqdorini kamaytirganga o'xshaydi, ammo MTR vositachiligidagi mitoxondriyal faollikka ta'sir qilmadi (4A–C-rasmlar).
Biz IPA ning LX-2 hujayralarida fibroz, apoptoz, omon qolish va mitoxondrial dinamika bilan bog'liq genlarning mRNK darajalari bilan bog'liqligini tekshirdik (5A–D-rasm). Nazorat guruhi bilan taqqoslaganda, TGF-β1 bilan davolangan guruhda kollagen I tip α2 zanjiri (COL1A2), α-silliq mushak aktin (αSMA), matritsa metalloproteinaza 2 (MMP2), metalloproteinaza 1 ning to'qima inhibitori (TIMP1) va dinamin 1 ga o'xshash gen (DRP1) kabi genlarning ekspressiyasi oshganligi kuzatildi, bu esa fibroz va faollashuvning oshganligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, nazorat guruhi bilan taqqoslaganda, TGF-β1 bilan davolash yadroviy pregnan X retseptorining (PXR), kaspaza 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-hujayra α inhibitori, yadroviy omil κ genining yorug'lik peptidi kuchaytiruvchisi (NFκB1A) va yadroviy omil κB kinaz subbirligi β inhibitori (IKBKB) ning mRNK darajasini pasaytirdi (5A–D-rasm). TGF-β1 bilan davolash bilan solishtirganda, TGF-β1 va IPA bilan kombinatsiyalangan davolash COL1A2 va MMP2 ekspressiyasini kamaytirdi, ammo PXR, TIMP1, B-hujayrali limfoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β va IKBKB mRNK darajasini oshirdi. IPA bilan davolash MMP2, Bcl-2 bilan bog'liq oqsil X (BAX), AKT1, optik atrofiya oqsili 1 (OPA1) va mitoxondrial sintez oqsili 2 (MFN2) ekspressiyasini sezilarli darajada kamaytirdi, CASP8, NFκB1A, NFκB1B va IKBKB ekspressiyasi esa nazorat guruhiga nisbatan oshdi. Biroq, kaspaza-3 (CASP3), apoptotik peptidaza faollashtiruvchi omil 1 (APAF1), mitoxondrial sintez oqsili 1 (MFN1) va bo'linish oqsili 1 (FIS1) ekspressiyasida hech qanday farq topilmadi. Umuman olganda, bu natijalar IPA bilan davolash fibroz, apoptoz, omon qolish va mitoxondrial dinamika bilan bog'liq genlarning ifodasini modulyatsiya qilishini ko'rsatadi. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, IPA bilan davolash LX-2 hujayralarida fibrozni kamaytiradi; shu bilan birga, u fenotipni inaktivatsiyaga yo'naltirish orqali omon qolishni rag'batlantiradi.
IPA LX-2 hujayralarida fibroblast, apoptotik, hayotiylik va mitoxondrial dinamika genlarining ifodasini modulyatsiya qiladi. Gistogrammalar LX-2 hujayralari zardobsiz muhitda 24 soat davomida TGF-β1 va IPA bilan induktsiya qilingandan so'ng, endogen nazoratga (RPLP0 yoki PPIA) nisbatan mRNA ifodasini ko'rsatadi. A fibroblastlarni, B apoptotik hujayralarni, C omon qolgan hujayralarni va D mitoxondrial dinamika genining ifodasini ko'rsatadi. Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish (SD) sifatida taqdim etilgan, n = 3 ta mustaqil tajriba. Statistik taqqoslashlar bir tomonlama ANOVA va Bonferroni post hoc testi yordamida amalga oshirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Keyin, hujayra hajmidagi (FSC-H) va sitoplazmatik murakkablikdagi (SSC-H) o'zgarishlar oqim sitometriyasi yordamida baholandi (6A, B-rasm) va IPA bilan davolashdan keyin hujayra morfologiyasidagi o'zgarishlar transmission elektron mikroskopiyasi (TEM) va fazali kontrastli mikroskopiya yordamida baholandi (Qo'shimcha 6A-B-rasm). Kutilganidek, TGF-β1 bilan davolangan guruhdagi hujayralar nazorat guruhiga nisbatan hajmi jihatidan oshdi (6A, B-rasm), bu qo'pol endoplazmatik retikulum (ER*) va fagolizosomalarning (P) klassik kengayishini ko'rsatdi, bu gematopoetik ildiz hujayralari (HSC) faollashuvini ko'rsatadi (Qo'shimcha 6A-rasm). Biroq, TGF-β1 bilan davolangan guruh bilan solishtirganda, TGF-β1 va IPA kombinatsiyalangan davolash guruhida hujayra hajmi, sitoplazmatik murakkablik (6A, B-rasm) va ER* miqdori kamaydi (Qo'shimcha 6A-rasm). Bundan tashqari, IPA bilan davolash nazorat guruhiga nisbatan hujayra hajmini, sitoplazmatik murakkablikni (6A, B-rasmlar), P va ER* miqdorini kamaytirdi (qo'shimcha 6A-rasm). Bundan tashqari, apoptotik hujayralar miqdori nazorat guruhiga nisbatan 24 soatlik IPA bilan davolashdan keyin oshdi (oq strelkalar, qo'shimcha 6B-rasm). Umuman olganda, bu natijalar 1 mM IPA HSC apoptozini rag'batlantirishi va TGF-β1 tomonidan qo'zg'atilgan hujayra morfologik parametrlaridagi o'zgarishlarni qaytarishi, shu bilan hujayra hajmi va murakkabligini tartibga solishi mumkinligini ko'rsatadi, bu esa HSC inaktivatsiyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
IPA LX-2 hujayralarida hujayra hajmi va sitoplazmatik murakkablikni o'zgartiradi. Oqim sitometriyasi tahlilining vakillik tasvirlari. Tahlilda LX-2 hujayralari uchun xos bo'lgan darvoza strategiyasi qo'llanildi: hujayra populyatsiyasini aniqlash uchun SSC-A/FSC-A, dubletlarni aniqlash uchun FSC-H/FSC-A va hujayra hajmi va murakkabligini tahlil qilish uchun SSC-H/FSC-H. Hujayralar TGF-β1 (5 ng/ml) va 1 mM IPA bilan zardobsiz muhitda 24 soat davomida inkubatsiya qilindi. LX-2 hujayralari hujayra hajmi va sitoplazmatik murakkablikni tahlil qilish uchun pastki chap kvadrantga (SSC-H-/FSC-H-), yuqori chap kvadrantga (SSC-H+/FSC-H-), pastki o'ng kvadrantga (SSC-H-/FSC-H+) va yuqori o'ng kvadrantga (SSC-H+/FSC-H+) taqsimlandi. B. Hujayra morfologiyasi FSC-H (oldinga sochilish, hujayra hajmi) va SSC-H (yon sochilish, sitoplazmatik murakkablik) (30 000 hodisa) yordamida oqim sitometriyasi yordamida tahlil qilindi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD, n = 3 ta mustaqil tajriba sifatida taqdim etilgan. Statistik taqqoslashlar bir tomonlama ANOVA va Bonferroni post hoc testi yordamida amalga oshirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 va ****p < 0.0001
IPA kabi ichak metabolitlari tadqiqotning dolzarb mavzusiga aylandi, bu esa ichak mikrobiotasida yangi nishonlar topilishi mumkinligini ko'rsatadi. Shuning uchun, biz odamlarda jigar fibrozi bilan bog'lagan metabolit IPA [15] hayvon modellarida potentsial antifibrotik birikma ekanligi ko'rsatilganligi qiziq [13, 14]. Bu yerda biz birinchi marta 2-toifa diabet (T2D) bo'lmagan semiz odamlarda sarum IPA va global jigar transkriptomikasi va DNK metilatsiyasi o'rtasidagi bog'liqlikni namoyish etamiz, apoptoz, mitofagiya va uzoq umr ko'rishni, shuningdek, jigar gomeostazini tartibga soluvchi AKT1 genining mumkin bo'lgan nomzodini ta'kidlaymiz. Tadqiqotimizning yana bir yangiligi shundaki, biz IPA bilan davolashning apoptoz, hujayra morfologiyasi, mitoxondrial bioenergetika va LX-2 hujayralarida dinamika bilan o'zaro ta'sirini ko'rsatdik, bu HSC fenotipini inaktivatsiyaga yo'naltiradigan pastroq energiya spektrini ko'rsatadi, bu esa IPA ni jigar fibrozini yaxshilash uchun potentsial nomzodga aylantiradi.
Biz apoptoz, mitofagiya va uzoq umr ko'rish qon aylanish zardobidagi IPA bilan bog'liq jigar genlarida boyitilgan eng muhim kanonik yo'llar ekanligini aniqladik. Mitoxondrial sifat nazorati (MQC) tizimining buzilishi mitoxondrial disfunktsiyaga, mitofagiya va apoptozga olib kelishi mumkin va shu bilan MASLD paydo bo'lishiga yordam beradi [33, 34]. Shuning uchun, biz IPA jigarda apoptoz, mitofagiya va uzoq umr ko'rish orqali hujayra dinamikasi va mitoxondrial yaxlitlikni saqlashda ishtirok etishi mumkin deb taxmin qilishimiz mumkin. Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, uchta tahlilda ikkita gen umumiy edi: YKT6 va AKT1. Shuni ta'kidlash kerakki, YKT6 hujayra membranalarining birlashishi jarayonida ishtirok etadigan SNARE oqsilidir. U autofagiya va mitofagiyada rol o'ynaydi, bu esa autofagiya va lizosomalarning birlashishiga yordam beradi [35]. Bundan tashqari, YKT6 funktsiyasining yo'qolishi mitofagiyaning buzilishiga olib keladi [36], YKT6 ning yuqori regulyatsiyasi esa gepatotsellyulyar karsinoma (HCC) rivojlanishi bilan bog'liq bo'lib, hujayralarning omon qolish darajasini oshiradi [37]. Boshqa tomondan, AKT1 eng muhim o'zaro ta'sir qiluvchi gen bo'lib, jigar kasalliklarida, jumladan, PI3K/AKT signalizatsiya yo'li, hujayra sikli, hujayra migratsiyasi, proliferatsiya, fokal adezyon, mitoxondrial funktsiya va kollagen sekretsiyasida muhim rol o'ynaydi [38-40]. Faollashtirilgan PI3K/AKT signalizatsiya yo'li hujayradan tashqari matritsa (ECM) ishlab chiqarish uchun mas'ul bo'lgan hujayralar bo'lgan gematopoetik ildiz hujayralarini (HSC) faollashtirishi mumkin va uning disregulyatsiyasi jigar fibrozining paydo bo'lishi va rivojlanishiga hissa qo'shishi mumkin [40]. Bundan tashqari, AKT p53 ga bog'liq hujayra apoptozini inhibe qiluvchi asosiy hujayra omon qolish omillaridan biridir va AKT faollashishi jigar hujayralari apoptozining inhibatsiyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin [41, 42]. Olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, IPA gepatotsitlarning apoptozga kirishi yoki omon qolishi o'rtasidagi qaroriga ta'sir qilish orqali jigar mitoxondriyalari bilan bog'liq apoptozda ishtirok etishi mumkin. Bu ta'sirlar jigar gomeostazisi uchun juda muhim bo'lgan AKT va/yoki YKT6 nomzod genlari tomonidan tartibga solinishi mumkin.
Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, 1 mM IPA TGF-β1 bilan davolashdan mustaqil ravishda LX-2 hujayralarida apoptozni keltirib chiqardi va mitoxondrial nafas olishni kamaytirdi. Shunisi e'tiborga loyiqki, apoptoz fibrozni bartaraf etish va gematopoetik ildiz hujayralari (HSC) faollashuvining asosiy yo'li bo'lib, jigar fibrozining qaytar fiziologik javobida ham muhim voqea hisoblanadi [4, 43]. Bundan tashqari, kombinatsiyalangan davolashdan so'ng LX-2 hujayralarida BHI ning tiklanishi IPA ning mitoxondrial bioenergetikani tartibga solishdagi potentsial roli haqida yangi tushunchalar berdi. Tinch va nofaol sharoitlarda gematopoetik hujayralar odatda ATP ishlab chiqarish uchun mitoxondrial oksidlovchi fosforillanishdan foydalanadi va past metabolik faollikka ega. Boshqa tomondan, HSC faollashuvi glikolitik holatga kirishning energiya talablarini qoplash uchun mitoxondrial nafas olish va biosintezni kuchaytiradi [44]. IPA metabolik potentsialga va ECARga ta'sir qilmagani glikolitik yo'l kamroq ustuvor ahamiyatga ega ekanligini ko'rsatadi. Xuddi shunday, yana bir tadqiqot shuni ko'rsatdiki, 1 mM IPA kardiomiotsitlar, inson gepatotsit hujayra liniyasi (Huh7) va inson kindik venasining endotelial hujayralarida (HUVEC) mitoxondrial nafas olish zanjiri faolligini modulyatsiya qila oldi; Biroq, IPA ning kardiomiotsitlardagi glikolizga ta'siri aniqlanmadi, bu IPA boshqa hujayra turlarining bioenergetikasiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatadi [45]. Shuning uchun, biz 1 mM IPA yumshoq kimyoviy ajratuvchi vazifasini bajarishi mumkin deb taxmin qilamiz, chunki u mtDNK miqdorini o'zgartirmasdan fibrogen gen ekspressiyasini, hujayra morfologiyasini va mitoxondrial bioenergetikani sezilarli darajada kamaytirishi mumkin [46]. Mitoxondrial ajratuvchilar madaniyat tomonidan qo'zg'atilgan fibroz va HSC faollashuvini inhibe qilishi mumkin [47] va ajratish oqsillari (UCP) yoki adenin nukleotid translokazasi (ANT) kabi ba'zi oqsillar tomonidan boshqariladigan yoki qo'zg'atiladigan mitoxondrial ATP ishlab chiqarishni kamaytirishi mumkin. Hujayra turiga qarab, bu hodisa hujayralarni apoptozdan himoya qilishi va/yoki apoptozni rag'batlantirishi mumkin [46]. Biroq, IPA ning gematopoetik ildiz hujayralarini inaktivatsiya qilishda mitoxondrial ajratuvchi sifatidagi rolini aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.
Keyin biz mitoxondrial nafas olishdagi o'zgarishlar tirik LX-2 hujayralarida mitoxondrial morfologiyada aks ettirilganmi yoki yo'qligini tekshirdik. Qizig'i shundaki, TGF-β1 bilan davolash mitoxondrial nisbatni sharsimondan oraliq holatga o'zgartiradi, mitoxondrial tarmoqlanishning pasayishi va mitoxondrial bo'linishning asosiy omili bo'lgan DRP1 ekspressiyasining ortishi bilan birga keladi [48]. Bundan tashqari, mitoxondrial parchalanish umumiy tarmoq murakkabligi bilan bog'liq va birlashishdan bo'linishga o'tish gematopoetik ildiz hujayralari (HSC) faollashuvi uchun juda muhimdir, mitoxondrial bo'linishni inhibe qilish esa HSC apoptoziga olib keladi [49]. Shunday qilib, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, TGF-β1 bilan davolash tarmoqlanishning pasayishi bilan mitoxondrial tarmoq murakkabligining pasayishiga olib kelishi mumkin, bu esa faollashtirilgan gematopoetik ildiz hujayralari (HSC) bilan bog'liq mitoxondrial bo'linishda ko'proq uchraydi. Bundan tashqari, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatdiki, IPA mitoxondrial nisbatni sharsimondan oraliq shaklga o'zgartirishi va shu bilan OPA1 va MFN2 ekspressiyasini kamaytirishi mumkin. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, OPA1 ning pasayishi mitoxondrial membrana potentsialining pasayishiga olib kelishi va hujayra apoptozini qo'zg'atishi mumkin [50]. MFN2 mitoxondrial sintez va apoptozni vositachilik qilishi ma'lum[51]. Olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, TGF-β1 va/yoki IPA tomonidan LX-2 hujayralarining induksiyasi mitoxondrial shakl va o'lchamni, shuningdek, faollashuv holati va tarmoq murakkabligini modulyatsiya qiladi.
Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, TGFβ-1 va IPA ni birgalikda davolash apoptozdan qochadigan hujayralarda fibroz, apoptoz va omon qolish bilan bog'liq genlarning mRNK ekspressiyasini tartibga solish orqali mtDNK va hujayra morfologik parametrlarini kamaytirishi mumkin. Darhaqiqat, IPA AKT1 ning mRNK ekspressiya darajasini va COL1A2 va MMP2 kabi muhim fibroz genlarini kamaytirdi, ammo apoptoz bilan bog'liq bo'lgan CASP8 ekspressiya darajasini oshirdi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatdiki, IPA bilan davolashdan so'ng BAX ekspressiyasi kamaydi va TIMP1 oilasining subbirliklari, BCL-2 va NF-κB ning mRNK ekspressiyasi oshdi, bu IPA apoptozdan qochadigan gematopoetik ildiz hujayralarida (HSC) omon qolish signallarini rag'batlantirishi mumkinligini ko'rsatadi. Bu molekulalar faollashtirilgan gematopoetik ildiz hujayralarida omon qolish signallari sifatida harakat qilishi mumkin, bu anti-apoptotik oqsillarning (masalan, Bcl-2) ifodalanishining ortishi, pro-apoptotik BAX ifodalanishining pasayishi va TIMP va NF-κB o'rtasidagi murakkab o'zaro ta'sir bilan bog'liq bo'lishi mumkin [5, 7]. IPA o'z ta'sirini PXR orqali amalga oshiradi va biz TGF-β1 va IPA bilan kombinatsiyalangan davolash PXR mRNA ifoda darajasini oshirganini aniqladik, bu HSC faollashuvining bostirilishini ko'rsatadi. Faollashtirilgan PXR signalizatsiyasi HSC faollashuvini ham in vivo, ham in vitro inhibe qilishi ma'lum [52, 53]. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, IPA apoptozni rag'batlantirish, fibroz va mitoxondrial metabolizmni kamaytirish va omon qolish signallarini kuchaytirish orqali faollashtirilgan HSClarni tozalashda ishtirok etishi mumkin, bu faollashtirilgan HSC fenotipini inaktivatsiyalanganga aylantiradigan odatiy jarayonlardir. IPA ning apoptozdagi potentsial mexanizmi va rolining yana bir mumkin bo'lgan izohi shundaki, u disfunktsional mitoxondriyalarni asosan mitofagiya (ichki yo'l) va tashqi TNF signalizatsiya yo'li (1-jadval) orqali yo'q qiladi, bu esa NF-κB omon qolish signalizatsiya yo'li bilan bevosita bog'liq (7-qo'shimcha rasm). Qizig'i shundaki, IPA bilan bog'liq boyitilgan genlar apoptoz yo'lida pro-apoptotik va pro-omon qolish signallarini qo'zg'atishga qodir [54], bu IPA ushbu genlar bilan o'zaro ta'sir qilish orqali apoptotik yo'lni yoki omon qolishni qo'zg'atishi mumkinligini ko'rsatadi. Biroq, IPA HSC faollashuvi paytida apoptozni yoki omon qolishni qanday qo'zg'atishi va uning mexanik yo'llari noma'lumligicha qolmoqda.
IPA - bu ichak mikrobiotasi orqali parhez triptofanidan hosil bo'lgan mikrobial metabolit. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, u ichak muhitida yallig'lanishga qarshi, antioksidant va epigenetik tartibga solish xususiyatlariga ega.[55] Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, IPA ichak to'siq funktsiyasini modulyatsiya qilishi va oksidlovchi stressni kamaytirishi mumkin, bu uning mahalliy fiziologik ta'siriga hissa qo'shishi mumkin.[56] Aslida, IPA qon aylanishi orqali maqsadli organlarga tashiladi va IPA triptofan, serotonin va indol hosilalari bilan o'xshash asosiy metabolit tuzilishiga ega bo'lganligi sababli, IPA metabolik ta'sir ko'rsatadi, natijada raqobatbardosh metabolik ta'sirga ega bo'ladi.[52] IPA fermentlar yoki retseptorlarga bog'lanish joylari uchun triptofandan olingan metabolitlar bilan raqobatlashishi mumkin, bu esa normal metabolik yo'llarni buzishi mumkin. Bu uning terapevtik oynasini yaxshiroq tushunish uchun uning farmakokinetikasi va farmakodinamikasi bo'yicha qo'shimcha tadqiqotlar o'tkazish zarurligini ta'kidlaydi.[57] Bu gematopoetik ildiz hujayralarida (HSC) ham sodir bo'lishi mumkinmi yoki yo'qmi, hali aniq emas.
Biz tadqiqotimizning ba'zi cheklovlari borligini tan olamiz. IPA bilan bog'liq aloqalarni aniq o'rganish uchun biz 2-toifa diabet (2-toifa diabet) bilan og'rigan bemorlarni chiqarib tashladik. Biz bu bizning topilmalarimizning 2-toifa diabet va jigar kasalligining rivojlangan bosqichiga ega bemorlarga keng qo'llanilishini cheklashini tan olamiz. Inson zardobidagi IPA ning fiziologik konsentratsiyasi 1–10 μM bo'lsa-da [11, 20], 1 mM IPA konsentratsiyasi eng yuqori toksik bo'lmagan konsentratsiya [15] va eng yuqori apoptoz tezligi asosida tanlandi, nekrotik hujayra populyatsiyasining foizida farq yo'q. Ushbu tadqiqotda IPA ning suprafiziologik darajalari qo'llanilgan bo'lsa-da, hozirda IPA ning samarali dozasi bo'yicha konsensus mavjud emas [52]. Bizning natijalarimiz ahamiyatli bo'lsa-da, IPA ning kengroq metabolik taqdiri tadqiqotning faol sohasi bo'lib qolmoqda. Bundan tashqari, sarum IPA darajalari va jigar transkriptlarining DNK metillanishi o'rtasidagi bog'liqlik haqidagi topilmalarimiz nafaqat gematopoetik ildiz hujayralaridan (HSC), balki jigar to'qimalaridan ham olingan. Biz transkriptom tahlilidan oldingi topilmalarimizga asoslanib, IPA gematopoetik ildiz hujayralari (HSC) faollashuvi bilan bog'liqligini va HSClar jigar fibrozining rivojlanishida ishtirok etadigan asosiy hujayralar ekanligini aniqladik [15] va HSClar jigar fibrozining rivojlanishida ishtirok etadigan asosiy hujayralardir. Jigar bir nechta hujayra turlaridan iborat, shuning uchun IPA rolini va uning boshqa jigar hujayralari turlari bilan o'zaro ta'sirini o'rganish uchun gepatotsit-HSC-immun hujayralar qo'shma madaniyat tizimi, kaspaza faollashuvi va DNK parchalanishi, shuningdek, oqsil darajasini o'z ichiga olgan ta'sir mexanizmi kabi boshqa hujayra modellarini ko'rib chiqish kerak.