Maqola "Dukkaklilarning patogenlar va zararkunandalarga chidamliligini oshirish" tadqiqot mavzusining bir qismidir, barcha 5 ta maqolani ko'ring.
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary zamburug'li o'simlik kasalligi nekrozi qo'zg'atuvchisi turli xil o'simliklarni yuqtirish uchun ko'p bosqichli strategiyadan foydalanadi. Ushbu tadqiqotda Pseudomonas sclerotiorum keltirib chiqaradigan oq mog'orga Phaseolus vulgaris L. ning molekulyar, fiziologik va biokimyoviy javoblarini kuchaytirish uchun muqobil boshqaruv strategiyasi sifatida boshqa muhim aminokislotalarning sintezini rag'batlantiruvchi oqsil bo'lmagan aminokislota diamin L-ornitindan foydalanish taklif qilinadi. In vitro tajribalar shuni ko'rsatdiki, L-ornitin S. pyrenoidosa mitselial o'sishini dozaga bog'liq ravishda sezilarli darajada inhibe qiladi. Bundan tashqari, u issiqxona sharoitida oq mog'orning og'irligini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin. Bundan tashqari, L-ornitin ishlov berilgan o'simliklarning o'sishini rag'batlantirdi, bu esa sinovdan o'tgan L-ornitin konsentratsiyalari ishlov berilgan o'simliklar uchun fitotoksik emasligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, L-ornitin fermentativ bo'lmagan antioksidantlarning (umumiy eruvchan fenollar va flavonoidlar) va fermentativ antioksidantlarning (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) va polifenol oksidaza (PPO)) ifodasini kuchaytirdi va uchta antioksidant bilan bog'liq genlarning (PvCAT1, PvSOD va PvGR) ifodasini oshirdi. Bundan tashqari, silika tahlilida S. sclerotiorum genomida taxminiy oksaloatsetat asetilgidrolaza (SsOAH) oqsili mavjudligi aniqlandi, bu funktsional tahlil, saqlangan domenlar va topologiya nuqtai nazaridan Aspergillus fijiensis (AfOAH) va Penicillium sp. (PlOAH) ning oksaloatsetat asetilgidrolaza (SsOAH) oqsillariga juda o'xshash edi. Qizig'i shundaki, L-ornitinni kartoshka dekstroza buloniga (PDB) qo'shilishi S. sclerotiorum mitseliyasida SsOAH genining ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi. Xuddi shunday, L-ornitinning ekzogen qo'llanilishi ishlov berilgan o'simliklardan yig'ilgan qo'ziqorin mitseliyasida SsOAH genining ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi. Nihoyat, L-ornitinning qo'llanilishi PDB muhitida ham, zararlangan barglarda ham oksalat kislotasi sekretsiyasini sezilarli darajada kamaytirdi. Xulosa qilib aytganda, L-ornitin zararlangan o'simliklarning oksidlanish-qaytarilish holatini saqlashda, shuningdek, himoya reaksiyasini kuchaytirishda muhim rol o'ynaydi. Ushbu tadqiqot natijalari oq mog'orni nazorat qilish va uning loviya ishlab chiqarish va boshqa ekinlarga ta'sirini yumshatish uchun innovatsion, ekologik toza usullarni ishlab chiqishga yordam berishi mumkin.
Nekrotrofik qo'ziqorin Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary tomonidan qo'zg'atilgan oq mog'or - bu global loviya (Phaseolus vulgaris L.) ishlab chiqarishiga jiddiy tahdid soladigan halokatli, hosildorlikni pasaytiruvchi kasallikdir (Bolton va boshqalar, 2006). Sclerotinia sclerotiorum tuproqda yuqadigan eng qiyin qo'ziqorin o'simlik patogenlaridan biri bo'lib, 600 dan ortiq o'simlik turlarining keng doirasiga ega va xost to'qimalarini nospesifik tarzda tezda yo'q qilish qobiliyatiga ega (Liang va Rollins, 2018). Noqulay sharoitlarda u hayot siklining muhim bosqichidan o'tadi, uzoq vaqt davomida tuproqda "sklerotiya" deb ataladigan qora, qattiq, urug'simon tuzilmalar yoki yuqtirilgan o'simliklarning mitseliysi yoki poyasida oq, yumshoq o'smalar sifatida uxlab qoladi (Schwartz va boshqalar, 2005). S. sclerotiorum sklerotiya hosil qilishga qodir, bu unga yuqtirilgan dalalarda uzoq vaqt davomida omon qolish va kasallik paytida saqlanib qolish imkonini beradi (Schwartz va boshqalar, 2005). Sklerotiyalar ozuqaviy moddalarga boy, tuproqda uzoq vaqt saqlanib qolishi mumkin va keyingi infeksiyalar uchun asosiy inokulyator bo'lib xizmat qiladi (Schwartz va boshqalar, 2005). Qulay sharoitlarda sklerotiyalar unib chiqadi va havoda tarqaladigan sporalarni hosil qiladi, ular o'simlikning barcha yer usti qismlarini, jumladan, gullar, poyalar yoki dukkaklarni yuqtirishi mumkin (Schwartz va boshqalar, 2005).
Sclerotinia sclerotiorum o'zining mezbon o'simliklarini yuqtirish uchun ko'p bosqichli strategiyadan foydalanadi, bu sklerotial unib chiqishdan tortib simptomlar rivojlanishigacha bo'lgan bir qator muvofiqlashtirilgan hodisalarni o'z ichiga oladi. Dastlab, S. sclerotiorum apotetsiya deb ataladigan qo'ziqoringa o'xshash tuzilmalardan to'xtatilgan sporalar (askosporalar deb ataladi) ishlab chiqaradi, ular havoda tarqaladi va yuqtirilgan o'simlik qoldiqlarida harakatsiz sklerotiyalarga aylanadi (Bolton va boshqalar, 2006). Keyin qo'ziqorin o'simlik hujayra devorining pH qiymatini nazorat qilish, fermentativ degradatsiya va to'qima invaziyasini kuchaytirish (Hegedus va Rimmer, 2005) va mezbon o'simlikning oksidlovchi portlashini bostirish uchun virulentlik omili bo'lgan oksalat kislotasini ajratadi. Bu kislotalash jarayoni o'simlik hujayra devorini zaiflashtiradi, qo'ziqorin hujayra devorini degradatsiya qiluvchi fermentlarning (CWDE) normal va samarali ishlashi uchun qulay muhit yaratadi, bu esa patogenning jismoniy to'siqni yengib o'tishiga va mezbon to'qimalarga kirishiga imkon beradi (Marciano va boshqalar, 1983). S. sclerotiorum bir marta kirib borganida, poligalakturonaza va tsellyulaza kabi bir qator CWDElarni ajratib chiqaradi, bu esa uning infektsiyalangan to'qimalarda tarqalishini osonlashtiradi va to'qima nekrozini keltirib chiqaradi. Lezyonlar va gifalik matlarning rivojlanishi oq mog'orning xarakterli alomatlariga olib keladi (Hegedus va Rimmer, 2005). Shu bilan birga, mezbon o'simliklar patogen bilan bog'liq molekulyar naqshlarni (PAMP) naqshni aniqlash retseptorlari (PRR) orqali taniydilar va natijada himoya javoblarini faollashtiradigan bir qator signalizatsiya hodisalarini qo'zg'atadilar.
Kasalliklarni nazorat qilish bo'yicha o'nlab yillar davomida olib borilgan sa'y-harakatlarga qaramay, boshqa tijorat ekinlarida bo'lgani kabi, patogenning qarshiligi, omon qolishi va moslashuvchanligi tufayli loviyada ham yetarli darajada chidamli gerplazma yetishmasligi saqlanib qolmoqda. Shuning uchun kasalliklarni boshqarish juda qiyin va madaniy amaliyotlar, biologik nazorat va kimyoviy fungitsidlarning kombinatsiyasini o'z ichiga olgan yaxlit, ko'p qirrali strategiyani talab qiladi (O'Sullivan va boshqalar, 2021). Oq mog'orga qarshi kimyoviy kurash eng samarali hisoblanadi, chunki fungitsidlar to'g'ri va o'z vaqtida qo'llanilganda kasallikning tarqalishini samarali nazorat qilishi, infeksiyaning og'irligini kamaytirishi va hosil yo'qotilishini minimallashtirishi mumkin. Biroq, fungitsidlardan haddan tashqari foydalanish va ularga haddan tashqari ishonish S. sclerotiorum ning chidamli shtammlarining paydo bo'lishiga olib kelishi va maqsadli bo'lmagan organizmlarga, tuproq salomatligiga va suv sifatiga salbiy ta'sir ko'rsatishi mumkin (Le Cointe va boshqalar, 2016; Ceresini va boshqalar, 2024). Shuning uchun ekologik toza alternativalarni topish eng ustuvor vazifaga aylandi.
Putresin, spermidin, spermin va kadaverin kabi poliaminlar (PA) tuproq orqali yuqadigan o'simlik patogenlariga qarshi istiqbolli alternativa bo'lib xizmat qilishi mumkin, shu bilan xavfli kimyoviy fungitsidlardan foydalanishni to'liq yoki qisman kamaytiradi (Nehela va boshqalar, 2024; Yi va boshqalar, 2024). Yuqori o'simliklarda PAlar hujayra bo'linishi, differentsiatsiya va abiotik va biotik stresslarga javob berish kabi ko'plab fiziologik jarayonlarda ishtirok etadi (Killiny va Nehela, 2020). Ular antioksidantlar vazifasini bajarishi, reaktiv kislorod turlarini (ROS) tozalashga yordam berishi, oksidlanish-qaytarilish gomeostazini saqlab turishi (Nehela va Killiny, 2023), himoya bilan bog'liq genlarni qo'zg'atishi (Romero va boshqalar, 2018), turli metabolik yo'llarni tartibga solishi (Nehela va Killiny, 2023), endogen fitohormonlarni modulyatsiya qilishi (Nehela va Killiny, 2019), tizimli orttirilgan qarshilikni (SAR) o'rnatishi va o'simlik-patogen o'zaro ta'sirini tartibga solishi mumkin (Nehela va Killiny, 2020; Asija va boshqalar, 2022; Czerwoniec, 2022). Shuni ta'kidlash kerakki, o'simliklarni himoya qilishda PA ning o'ziga xos mexanizmlari va roli o'simlik turlari, patogenlar va atrof-muhit sharoitlariga qarab o'zgaradi. O'simliklardagi eng ko'p uchraydigan PA muhim poliamin L-ornitindan biosintezlanadi (Killiny va Nehela, 2020).
L-ornitin o'simliklarning o'sishi va rivojlanishida ko'p rol o'ynaydi. Masalan, avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, guruchda (Oryza sativa) ornitin azotni qayta ishlash (Liu va boshqalar, 2018), guruch hosildorligi, sifati va xushbo'yligi (Lu va boshqalar, 2020) va suv stressiga javob berish (Yang va boshqalar, 2000) bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, L-ornitinning ekzogen qo'llanilishi qand lavlagi (Beta vulgaris) da qurg'oqchilikka chidamlilikni sezilarli darajada oshirdi (Hussein va boshqalar, 2019) va piyoz (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu va Çavuşoǧlu, 2021) va kaju (Anacardium occidentale) o'simliklarida tuz stressini yumshatdi (da Rocha va boshqalar, 2012). L-ornitinning abiotik stressdan himoyalanishdagi potentsial roli uning ishlov berilgan o'simliklarda prolin to'planishida ishtirok etishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Masalan, prolin metabolizmi bilan bog'liq genlar, masalan, ornitin delta aminotransferaza (delta-OAT) va prolin dehidrogenaza (ProDH1 va ProDH2) genlari, ilgari Nicotiana benthamiana va Arabidopsis thaliana ni mezbon bo'lmagan Pseudomonas syringae shtammlaridan himoya qilishda ishtirok etishi haqida xabar berilgan edi (Senthil-Kumar va Mysore, 2012). Boshqa tomondan, qo'ziqorin ornitin dekarboksilazasi (ODC) patogenlarning o'sishi uchun zarur (Singh va boshqalar, 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ning ODC ni mezbon tomonidan qo'zg'atilgan genlarni susaytirish (HIGS) orqali nishonga olish pomidor o'simliklarining Fusarium so'lishiga chidamliligini sezilarli darajada oshirdi (Singh va boshqalar, 2020). Biroq, ekzogen ornitinni fitopatogenlar kabi biotik stresslarga qarshi qo'llashning potentsial roli yaxshi o'rganilmagan. Eng muhimi, ornitinning kasalliklarga chidamliligiga va unga bog'liq biokimyoviy va fiziologik hodisalarga ta'siri hali ham o'rganilmagan.
Dukkaklilarning S. sclerotiorum infektsiyasining murakkabligini tushunish samarali nazorat strategiyalarini ishlab chiqish uchun muhimdir. Ushbu tadqiqotda biz dukkakli o'simliklarning himoya mexanizmlari va Sclerotinia sclerotiorum infektsiyasiga chidamliligini oshirishda asosiy omil sifatida diamin L-ornitinning potentsial rolini aniqlashga intildik. Biz yuqtirilgan o'simliklarning himoya reaksiyalarini kuchaytirishdan tashqari, L-ornitin oksidlanish-qaytarilish holatini saqlab qolishda ham muhim rol o'ynaydi, deb taxmin qilamiz. Biz L-ornitinning potentsial ta'siri fermentativ va fermentativ bo'lmagan antioksidant himoya mexanizmlarini tartibga solish va qo'ziqorin patogenligi/virulentlik omillari va ular bilan bog'liq oqsillarga aralashish bilan bog'liq deb taxmin qilamiz. L-ornitinning bu ikki tomonlama funksiyasi uni oq mog'orning ta'sirini yumshatish va keng tarqalgan dukkakli ekinlarning bu kuchli qo'ziqorin patogeniga chidamliligini oshirish bo'yicha barqaror strategiya uchun istiqbolli nomzodga aylantiradi. Ushbu tadqiqot natijalari oq mog'orni nazorat qilish va uning dukkaklilar ishlab chiqarishga ta'sirini yumshatish uchun innovatsion, ekologik toza usullarni ishlab chiqishda yordam berishi mumkin.
Ushbu tadqiqotda tajriba materiali sifatida Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) kabi oddiy loviyaning sezgir tijorat navi ishlatilgan. Misr Qishloq xo'jaligi tadqiqotlari markazi (ARC), Dala ekinlari tadqiqot instituti (FCRI), Dukkaklilar tadqiqot bo'limi tomonidan sog'lom urug'lar taqdim etildi. Issiqxona sharoitida (25 ± 2 °C, nisbiy namlik 75 ± 1%, 8 soat yorug'lik/16 soat qorong'i) S. sclerotiorum bilan kasallangan tuproq bilan to'ldirilgan plastik idishlarga (ichki diametri 35 sm, chuqurligi 50 sm) beshta urug' ekildi. Ekilgandan 7-10 kun o'tgach (DPS), har bir idishda faqat bir xil o'sadigan ikkita ko'chat va uchta to'liq ochilgan barg qoldirish uchun ko'chatlar yupqalashtirildi. Barcha idishdagi o'simliklar har ikki haftada bir marta sug'orildi va berilgan nav uchun tavsiya etilgan me'yorda har oyda urug'lantirildi.
500 mg/L konsentratsiyali L-ornitindiamin (shuningdek, (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik kislota sifatida ham tanilgan; Sigma-Aldrich, Darmshtadt, Germaniya) konsentratsiyasini tayyorlash uchun avval 50 mg 100 ml steril distillangan suvda eritildi. Keyin asosiy eritma suyultirildi va keyingi tajribalarda ishlatildi. Qisqacha aytganda, oltita L-ornitin konsentratsiyasi (12,5, 25, 50, 75, 100 va 125 mg/L) in vitro sinovdan o'tkazildi. Bundan tashqari, steril distillangan suv salbiy nazorat (Mock) sifatida va tijorat fungitsid "Rizolex-T" 50% namlanadigan kukuni (toklofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, G'arbiya gubernatorligi, Misr) musbat nazorat sifatida ishlatilgan. “Rizolex-T” tijorat fungitsid in vitro sharoitida beshta konsentratsiyada (2, 4, 6, 8 va 10 mg/L) sinovdan o'tkazildi.
Oq mog'orning odatiy alomatlarini ko'rsatadigan (infektsiya darajasi: 10–30%) oddiy loviya poyalari va dukkaklarining namunalari tijorat fermalaridan to'plandi. Zararlangan o'simlik materiallarining aksariyati tur/nav bo'yicha aniqlangan bo'lsa-da (sezgir tijorat navi Giza 3), boshqalari, ayniqsa mahalliy bozorlardan olinganlari, noma'lum turlarga mansub edi. To'plangan zararlangan materiallar avval 0,5% natriy gipoxlorit eritmasi bilan 3 daqiqa davomida sirt dezinfektsiya qilindi, so'ngra steril distillangan suv bilan bir necha marta yuvildi va ortiqcha suvni olib tashlash uchun steril filtr qog'ozi bilan artib quritildi. Keyin zararlangan organlar o'rta to'qimadan (sog'lom va zararlangan to'qimalar orasidan) kichik bo'laklarga kesildi, kartoshka dekstroza agari (PDA) muhitida o'stirildi va sklerotiya hosil bo'lishini rag'batlantirish uchun 25 ± 2 °C da 12 soat yorug'lik/12 soat qorong'u sikl bilan 5 kun davomida inkubatsiya qilindi. Mitseliy uchi usuli aralash yoki ifloslangan madaniyatlardan qo'ziqorin izolatlarini tozalash uchun ham qo'llanildi. Tozalangan zamburug' izolyati avval uning madaniy morfologik xususiyatlariga asoslanib aniqlandi va keyin mikroskopik xususiyatlarga asoslanib S. sclerotiorum ekanligi tasdiqlandi. Nihoyat, barcha tozalangan izolatlar Koch postulatlariga javob berish uchun sezgir keng tarqalgan loviya Giza 3 navida patogenlik uchun sinovdan o'tkazildi.
Bundan tashqari, eng invaziv S. sclerotiorum izolyati (3-izolat) White va boshqalar, 1990; Baturo-Ciesniewska va boshqalar, 2017 tomonidan tasvirlanganidek, ichki transkripsiyalangan spacer (ITS) ketma-ketligi asosida qo'shimcha ravishda tasdiqlandi. Qisqacha aytganda, izolatlar kartoshka dekstroza bulonida (PDB) o'stirildi va 25 ± 2 °C da 5-7 kun davomida inkubatsiya qilindi. Keyin qo'ziqorin mitseliysi yig'ildi, doka orqali filtrlandi, ikki marta steril suv bilan yuvildi va steril filtr qog'ozi bilan quritildi. Genom DNKsi Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah va boshqalar, 2022, 2024) yordamida ajratildi. Keyin ITS rDNK mintaqasi maxsus primer juftligi ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; kutilgan hajmi: 540 bp) yordamida kuchaytirildi (Baturo-Ciesniewska va boshqalar, 2017). Tozalangan PZR mahsulotlari ketma-ketlik uchun taqdim etildi (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNK ketma-ketliklari Sanger ketma-ketlik usuli yordamida ikki tomonlama ketma-ketlikda ketma-ketlikda amalga oshirildi. Keyin yig'ilgan so'rov ketma-ketliklari BLASTn dasturi yordamida GenBank va Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) dagi so'nggi ma'lumotlar bilan taqqoslandi. So'rovlar ketma-ketligi NCBI GenBank (Qo'shimcha jadval S1) dagi so'nggi ma'lumotlardan olingan 20 ta boshqa S. sclerotiorum shtammlari/izolatlari bilan Molekulyar Evolyutsion Genetika Tahlil Paketidagi (MEGA-11; 11-versiya) ClustalW yordamida taqqoslandi (Kumar va boshqalar, 2024). Evolyutsion tahlil maksimal ehtimollik usuli va umumiy vaqt bo'yicha qaytariladigan nukleotid almashtirish modeli yordamida amalga oshirildi (Nei va Kumar, 2000). Eng yuqori log-ehtimollikka ega daraxt ko'rsatilgan. Evristik qidiruv uchun boshlang'ich daraxt qo'shni-qo'shilish (NJ) daraxti (Kumar va boshqalar, 2024) va maksimal parsimoniya (MP) daraxti o'rtasida yuqori log-ehtimollikka ega daraxtni tanlash orqali tanlanadi. NJ daraxti umumiy vaqt bo'yicha qaytariladigan model yordamida hisoblangan juft masofa matritsasi yordamida qurilgan (Nei va Kumar, 2000).
L-ornitin va “Rizolex-T” bakteritsidining antibakterial faolligi in vitro sharoitida agar diffuziya usuli bilan aniqlandi. Usul: L-ornitinning kerakli miqdordagi eritmasini (500 mg/L) oling va uni 10 ml PDA ozuqaviy muhiti bilan yaxshilab aralashtirib, mos ravishda 12,5, 25, 50, 75, 100 va 125 mg/L yakuniy konsentratsiyali eritmalar tayyorlang. Nazorat sifatida besh konsentratsiyali “Rizolex-T” fungitsid (2, 4, 6, 8 va 10 mg/L) va steril distillangan suv ishlatilgan. Muhit qotib qolgandan so'ng, diametri 4 mm bo'lgan yangi tayyorlangan Sclerotinia sclerotiorum kulturasining mitselial vilkasi Petri idishining markaziga o'tkazildi va mitseliy butun nazorat Petri idishini qoplaguncha 25±2°C da kultivatsiya qilindi, shundan so'ng qo'ziqorin o'sishi qayd etildi. 1-tenglama yordamida S. sclerotiorum ning radial o'sishining foizli inhibisyonini hisoblang:
Tajriba ikki marta takrorlandi, har bir nazorat/tajriba guruhi uchun oltita biologik replikatsiya va har bir biologik replikatsiya uchun beshta idish (har bir idishda ikkita o'simlik) bilan. Tajriba natijalarining aniqligi, ishonchliligi va takrorlanishini ta'minlash uchun har bir biologik replika ikki marta (ikkita texnik replika) tahlil qilindi. Bundan tashqari, yarim maksimal inhibitiv konsentratsiyani (IC50) va IC99 ni hisoblash uchun probit regressiya tahlili qo'llanildi (Prentice, 1976).
Issiqxona sharoitida L-ornitinning potentsialini baholash uchun ketma-ket ikkita idish tajribasi o'tkazildi. Qisqacha aytganda, idishlar sterillangan loy-qumli tuproq (3:1) bilan to'ldirildi va yangi tayyorlangan S. sclerotiorum kulturasi bilan emlandi. Birinchidan, S. sclerotiorumning eng invaziv izolyati (3-izolyat) bitta sklerotiumni ikkiga bo'lib, uni PDA ustiga yuzi pastga qaratib qo'yib va ​​mitseliy o'sishini rag'batlantirish uchun 25°C da doimiy qorong'ulikda (24 soat) 4 kun davomida inkubatsiya qilish orqali kultivatsiya qilindi. Keyin oldingi chetidan to'rtta 5 mm diametrli agar tiqinlari olindi va 100 g bug'doy va guruch kepagi steril aralashmasi (1:1, v/v) bilan emlandi va barcha kolbalar sklerotiya hosil bo'lishini rag'batlantirish uchun 25 ± 2 °C da 12 soat yorug'lik/12 soat qorong'ulik sikli ostida 5 kun davomida inkubatsiya qilindi. Tuproq qo'shishdan oldin bir xillikni ta'minlash uchun barcha kolbalarning tarkibi yaxshilab aralashtirildi. Keyin, patogenlarning doimiy konsentratsiyasini ta'minlash uchun har bir idishga 100 g kolonizatsiya qiluvchi kepak aralashmasi qo'shildi. Emlangan idishlar zamburug'larning o'sishini faollashtirish uchun sug'orildi va 7 kun davomida issiqxona sharoitida joylashtirildi.
Keyin har bir idishga Giza 3 navining beshta urug'i ekildi. L-ornitin va Rizolex-T fungitsid bilan ishlov berilgan idishlar uchun sterilizatsiya qilingan urug'lar avval ikki birikmaning suvli eritmasida ikki soat davomida taxminan 250 mg/L va 50 mg/L yakuniy IC99 konsentratsiyasi bilan namlandi va keyin ekishdan oldin bir soat davomida havoda quritildi. Boshqa tomondan, urug'lar salbiy nazorat sifatida steril distillangan suvda namlandi. 10 kundan so'ng, birinchi sug'orishdan oldin, ko'chatlar yupqalashtirildi va har bir idishda faqat ikkita toza ko'chat qoldi. Bundan tashqari, S. sclerotiorum bilan infektsiyalanganligiga ishonch hosil qilish uchun, bir xil rivojlanish bosqichidagi (10 kun) loviya o'simligi poyalari sterilizatsiya qilingan skalpel yordamida ikki xil joyda kesildi va har bir yaraga taxminan 0,5 g kolonizatsiya qiluvchi kepak aralashmasi joylashtirildi, so'ngra barcha emlangan o'simliklarda infeksiya va kasallik rivojlanishini rag'batlantirish uchun yuqori namlik qo'llanildi. Nazorat o'simliklari ham shunga o'xshash tarzda jarohatlangan va yaraga teng miqdorda (0,5 g) steril, kolonizatsiya qilinmagan kepak aralashmasi joylashtirilgan va kasallik rivojlanishi uchun muhitni simulyatsiya qilish va davolash guruhlari o'rtasida izchillikni ta'minlash maqsadida yuqori namlikda saqlangan.
Davolash usuli: Loviya ko'chatlari tuproqni sug'orish orqali 500 ml L-ornitin (250 mg/l) suvli eritmasi yoki Rizolex-T fungitsid (50 mg/l) bilan sug'orildi, so'ngra ishlov berish 10 kunlik interval bilan uch marta takrorlandi. Platsebo bilan ishlov berilgan nazorat guruhlari 500 ml steril distillangan suv bilan sug'orildi. Barcha ishlov berish issiqxona sharoitida (25 ± 2°C, 75 ± 1% nisbiy namlik va 8 soat yorug'lik/16 soat qorong'i fotoperiod) amalga oshirildi. Barcha idishlar ikki haftada bir marta sug'orildi va har oyda muvozanatli NPK o'g'iti (20-20-20, 3,6% oltingugurt va TE mikroelementlari bilan; Zain Seeds, Misr) bilan 3-4 g/l konsentratsiyada ma'lum nav uchun tavsiyalar va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq barg purkash orqali ishlov berildi. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, to'liq kengaygan yetilgan barglar (yuqoridan 2 va 3-barglar) har bir biologik replikatsiyadan ishlov berilgandan keyin 72 soat o'tgach (hpt) yig'ib olindi, gomogenlashtirildi, birlashtirildi va -80 °C da oksidlovchi stress indikatorlarining in situ gistokimyoviy lokalizatsiyasi, lipid peroksidlanishi, fermentativ va fermentativ bo'lmagan antioksidantlar va gen ekspressiyasini o'z ichiga olgan, ammo ular bilan cheklanmagan holda, keyingi tahlillar uchun saqlandi.
Oq mog'or infektsiyasining intensivligi emlashdan keyin 21 kun ichida haftasiga 1–9 shkalasi (Qo'shimcha S2 jadvali) yordamida Teran va boshqalar (2006) tomonidan o'zgartirilgan Petzoldt va Dikson shkalasi (1996) asosida baholandi. Qisqacha aytganda, loviya o'simliklarining poyalari va shoxlari emlash nuqtasidan boshlab, tugunlar va tugunlar bo'ylab lezyonlarning rivojlanishini kuzatib bordi. Keyin lezyonning emlash nuqtasidan poya yoki shox bo'ylab eng uzoq nuqtagacha bo'lgan masofasi o'lchandi va lezyonning joylashuviga qarab 1–9 ball berildi, bu yerda (1) emlash nuqtasi yaqinida ko'rinadigan infeksiya yo'qligini va (2–9) lezyon hajmining asta-sekin o'sishini va tugunlar/tugunlar bo'ylab rivojlanishini ko'rsatdi (Qo'shimcha S2 jadvali). Keyin oq mog'or infektsiyasining intensivligi 2-formula yordamida foizga aylantirildi:
Bundan tashqari, kasallikning rivojlanish egri chizig'i ostidagi maydon (AUDPC) yaqinda oddiy loviyaning oq chirishiga moslashtirilgan formula (Shaner va Finney, 1977) yordamida 3-tenglama yordamida hisoblab chiqildi:
Bu yerda Yi = ti vaqtidagi kasallikning og'irligi, Yi+1 = keyingi vaqtdagi kasallikning og'irligi ti+1, ti = birinchi o'lchov vaqti (kunlarda), ti+1 = keyingi o'lchov vaqti (kunlarda), n = vaqt nuqtalari yoki kuzatuv nuqtalarining umumiy soni. O'simlik balandligi (sm), har bir o'simlikdagi shoxlar soni va har bir o'simlikdagi barglar soni kabi loviya o'simligining o'sish parametrlari barcha biologik replikalarda 21 kun davomida haftalik ravishda qayd etildi.
Har bir biologik replikada barg namunalari (tepadan ikkinchi va uchinchi to'liq rivojlangan barglar) ishlov berilgandan keyingi 45-kuni (oxirgi ishlov berilgandan 15 kun o'tgach) to'plandi. Har bir biologik replika beshta idishdan iborat edi (har bir idishda ikkita o'simlik). Taxminan 500 mg maydalangan to'qima qorong'ida 4 °C da 80% aseton yordamida fotosintetik pigmentlarni (xlorofill a, xlorofill b va karotenoidlar) ajratib olish uchun ishlatilgan. 24 soatdan so'ng namunalar santrifugaga solindi va supernatant xlorofill a, xlorofill b va karotenoid tarkibini UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) yordamida kolorimetrik ravishda aniqlash uchun uch xil to'lqin uzunliklarida (A470, A646 va A663 nm) yutilishni o'lchash orqali to'plandi. Nihoyat, fotosintetik pigmentlarning miqdori Lichtenthaler (1987) tomonidan tasvirlangan quyidagi 4-6 formulalar yordamida hisoblab chiqildi.
Davolashdan 72 soat o'tgach (hpt), vodorod peroksid (H2O2) va superoksid anionining (O2•−) joyida gistokimyoviy lokalizatsiyasi uchun har bir biologik replikatsiyadan barglar (yuqoridan ikkinchi va uchinchi to'liq rivojlangan barglar) yig'ib olindi. Har bir biologik replikatsiya beshta idishdan iborat edi (har bir idishda ikkita o'simlik). Usulning aniqligi, ishonchliligi va takrorlanishini ta'minlash uchun har bir biologik replikatsiya ikki nusxada (ikkita texnik replika) tahlil qilindi. H2O2 va O2•− mos ravishda 0,1% 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germaniya) yoki nitroko'k tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germaniya) yordamida, Romero-Puertas va boshqalar (2004) va Adam va boshqalar (1989) tomonidan kichik o'zgartirishlar bilan tasvirlangan usullarga amal qilib aniqlandi. H2O2 ning joyida gistokimyoviy lokalizatsiyasi uchun varaqalar 10 mM Tris buferida (pH 7.8) 0.1% DAB bilan vakuumda infiltratsiya qilindi va keyin xona haroratida yorug'likda 60 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Varaqalar 4:1 (v/v) etanol:xloroformda (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qohira, Misr) 0.15% (v/v) TCA da oqartirildi va keyin qorong'ilashguncha yorug'likka qo'yildi. Xuddi shunday, klapanlar O2•− ning joyida gistokimyoviy lokalizatsiyasi uchun 0.1 w/v % HBT ni o'z ichiga olgan 10 mM kaliy fosfat buferi (pH 7.8) bilan vakuumda infiltratsiya qilindi. Varaqalar xona haroratida yorug'likda 20 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, keyin yuqoridagi kabi oqartirildi va keyin to'q ko'k/binafsha dog'lar paydo bo'lguncha yoritildi. Olingan jigarrang (H2O2 indikatori sifatida) yoki ko'k-binafsha (O2•− indikatori sifatida) rangining intensivligi ImageJ tasvirni qayta ishlash paketining Fiji versiyasi yordamida baholandi (http://fiji.sc; 2024-yil 7-martda kirish mumkin).
Malondialdegid (MDA; lipid peroksidlanishining markeri sifatida) Du va Bramlage (1992) usuliga ko'ra ozgina o'zgartirishlar bilan aniqlandi. Har bir biologik replikatsiyadan (yuqoridan ikkinchi va uchinchi to'liq rivojlangan barglar) barglar ishlov berilgandan 72 soat o'tgach (hpt) yig'ib olindi. Har bir biologik replikatsiya beshta idishdan (har bir idishda ikkita o'simlik) iborat edi. Har bir biologik replikatsiya usulning aniqligi, ishonchliligi va takrorlanishini ta'minlash uchun ikki nusxada (ikkita texnik replika) tahlil qilindi. Qisqacha aytganda, MDA ekstraktsiyasi uchun 0,5 g maydalangan barg to'qimasi 0,01% butillangan gidroksitoluol (BHT; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) o'z ichiga olgan 20% triklorosirka kislotasi (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, AQSh) bilan ishlatilgan. Keyin supernatantdagi MDA miqdori UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) yordamida 532 va 600 nm da absorbsiyani o'lchash orqali kolorimetrik tarzda aniqlandi va keyin nmol g−1 FW sifatida ifodalandi.
Fermentativ bo'lmagan va fermentativ antioksidantlarni baholash uchun har bir biologik replikatsiyadan ishlov berilgandan 72 soat o'tgach (hpt) barglar (tepadan ikkinchi va uchinchi to'liq rivojlangan barglar) yig'ib olindi. Har bir biologik replikatsiya beshta idishdan iborat edi (har bir idishda ikkita o'simlik). Har bir biologik namuna ikki nusxada tahlil qilindi (ikkita texnik namuna). Ikki barg suyuq azot bilan maydalandi va fermentativ va fermentativ bo'lmagan antioksidantlarni, umumiy aminokislotalarni, prolin miqdorini, gen ekspressiyasini va oksalat miqdorini aniqlash uchun to'g'ridan-to'g'ri ishlatildi.
Umumiy eruvchan fenol miqdori Folin-Ciocalteu reaktivi (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) yordamida Kahkonen va boshqalar (1999) tomonidan tasvirlangan usulga ozgina o'zgartirishlar kiritilgan holda aniqlandi. Qisqacha aytganda, taxminan 0,1 g gomogenlangan barg to'qimasi 20 ml 80% metanol bilan qorong'ida 24 soat davomida ekstraktsiya qilindi va supernatant santrifugadan so'ng yig'ib olindi. Namuna ekstraktining 0,1 ml i 0,5 ml Folin-Ciocalteu reaktivi (10%) bilan aralashtirildi, 30 soniya davomida chayqatildi va qorong'ida 5 daqiqaga qoldirildi. Keyin har bir naychaga 0,5 ml 20% natriy karbonat eritmasi (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Qohira, Misr) qo'shildi, yaxshilab aralashtirildi va xona haroratida qorong'ida 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, reaksiya aralashmasining yutilishi 765 nm da UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) yordamida o'lchandi. Namuna ekstraktlaridagi umumiy eruvchan fenollarning konsentratsiyasi gallik kislota kalibrlash egri chizig'i (Fisher Scientific, Hampton, NH, AQSh) yordamida aniqlandi va yangi og'irlikdagi har bir gramm uchun gallik kislota ekvivalentining milligrammi sifatida ifodalandi (mg GAE g-1 yangi og'irlik).
Eriydigan flavonoidlarning umumiy miqdori Djeridan va boshqalar (2006) usuliga ko'ra ozgina o'zgartirishlar bilan aniqlandi. Qisqacha aytganda, yuqoridagi metanol ekstraktining 0,3 ml i 0,3 ml 5% alyuminiy xlorid eritmasi (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, AQSh) bilan aralashtirildi, kuchli aralashtirildi va keyin xona haroratida 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra 0,3 ml 10% kaliy asetat eritmasi (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qohira, Misr) qo'shildi, yaxshilab aralashtirildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida qorong'ida inkubatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, reaksiya aralashmasining yutilishi UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) yordamida 430 nm da o'lchandi. Namuna ekstraktlaridagi umumiy eruvchan flavonoidlarning konsentratsiyasi rutin kalibrlash egri chizig'i (TCI America, Portland, OR, AQSh) yordamida aniqlandi va keyin yangi vaznning har bir grammiga rutin ekvivalenti milligramm sifatida ifodalandi (mg RE g-1 yangi vazn).
Loviya barglarining umumiy erkin aminokislota miqdori Yokoyama va Hiramatsu (2003) tomonidan taklif qilingan va Sun va boshqalar (2006) tomonidan modifikatsiyalangan usulga asoslangan modifikatsiyalangan ninhidrin reaktivi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, AQSh) yordamida aniqlandi. Qisqacha aytganda, 0,1 g maydalangan to'qima pH 5,4 bufer bilan ekstraksiya qilindi va 200 mkL supernatant 200 mkL ninhidrin (2%) va 200 mkL piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, AQSh) bilan reaksiyaga kirishdi, 30 daqiqa davomida qaynoq suv hammomida inkubatsiya qilindi, so'ngra sovutildi va UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) yordamida 580 nm da o'lchandi. Boshqa tomondan, prolin Bates usuli bilan aniqlandi (Bates va boshqalar, 1973). Prolin 3% sulfosalitsil kislotasi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, AQSh) bilan ekstraksiya qilindi va santrifüjdan so'ng, 0,5 ml supernatant 1 ml muzlik sirka kislotasi (Fisher Scientific, Hampton, NH, AQSh) va ningidrin reaktivi bilan aralashtirildi, 90°C da 45 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi, sovutildi va yuqoridagi kabi spektrofotometr yordamida 520 nm da o'lchandi. Barg ekstraktlaridagi umumiy erkin aminokislotalar va prolin mos ravishda glisin va prolin kalibrlash egri chiziqlari (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) yordamida aniqlandi va mg/g yangi og'irlik sifatida ifodalandi.
Antioksidant fermentlarning fermentativ faolligini aniqlash uchun taxminan 500 mg gomogenlangan to'qima 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) va 7,5% polivinilpirrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) o'z ichiga olgan 3 ml 50 mM Tris buferi (pH 7,8) bilan ekstraksiya qilindi, 10 000 × g tezlikda 20 daqiqa davomida sovutish (4 °C) ostida santrifuga qilindi va supernatant (xom ferment ekstrakti) yig'ildi (El-Nagar va boshqalar, 2023; Osman va boshqalar, 2023). Keyin katalaza (CAT) 2 ml 0,1 M natriy fosfat buferi (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) va 100 mkl 269 mM H2O2 eritmasi bilan reaksiyaga kirishib, uning fermentativ faolligini Aebi (1984) usuliga muvofiq, ozgina o'zgartirishlar bilan aniqladi (El-Nagar va boshqalar, 2023; Osman va boshqalar, 2023). Guaiacolga bog'liq peroksidaza (POX) fermentativ faolligi Harrach va boshqalar (2009) usuli yordamida aniqlandi. (2008) kichik o'zgartirishlar bilan (El-Nagar va boshqalar, 2023; Osman va boshqalar, 2023) va polifenol oksidaza (PPO) ning fermentativ faolligi 2,2 ml 100 mM natriy fosfat buferi (pH 6,0), 100 mkl guayakol (TCI kimyoviy moddalari, Portlend, OR, AQSh) va 100 mkl 12 mM H2O2 bilan reaksiyaga kirishgandan so'ng aniqlandi. Usul (El-Nagar va boshqalar, 2023; Osman va boshqalar, 2023) dan biroz o'zgartirildi. Tahlil 0,1 M fosfat buferida (pH 6,0) yangi tayyorlangan 3 ml katexol eritmasi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, AQSh) (0,01 M) bilan reaksiyaga kirishgandan so'ng amalga oshirildi. CAT faolligi H2O2 ning 240 nm (A240) da parchalanishini kuzatish orqali o'lchandi, POX faolligi 436 nm (A436) da yutilishning oshishini kuzatish orqali o'lchandi va PPO faolligi UV-160A spektrofotometri (Shimadzu, Yaponiya) yordamida har 30 soniyada 3 daqiqa davomida 495 nm (A495) da yutilish tebranishlarini qayd etish orqali o'lchandi.
Oxirgi ishlov berishdan 72 soat o'tgach, loviya barglarida (yuqoridan ikkinchi va uchinchi to'liq rivojlangan barglar) peroksisomal katalaza (PvCAT1; GenBank Accession № KF033307.1), superoksid dismutaza (PvSOD; GenBank Accession № XM_068639556.1) va glutation reduktaza (PvGR; GenBank Accession № KY195009.1) kabi uchta antioksidant bilan bog'liq genlarning transkript darajasini aniqlash uchun real vaqtda RT-PCR ishlatilgan. Qisqacha aytganda, RNK ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Xitoy) yordamida ajratilgan. Keyin, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq TOP script™ cDNA Synthesis Kit yordamida kDNK sintez qilingan. Yuqoridagi uchta genning primer ketma-ketliklari S3 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. PvActin-3 (GenBank kirish raqami: XM_068616709.1) uy xo'jaligi geni sifatida ishlatilgan va nisbiy gen ekspressiyasi 2-ΔΔCT usuli yordamida hisoblangan (Livak va Schmittgen, 2001). Biotik stress (oddiy dukkaklilar va antraknoz qo'ziqorini Colletotrichum lindemuthianum o'rtasidagi nomuvofiq o'zaro ta'sir) va abiotik stress (qurg'oqchilik, sho'rlanish, past harorat) sharoitida aktin barqarorligi ko'rsatildi (Borges va boshqalar, 2012).
Dastlab biz S. sclerotiorumdagi oksaloatsetat asetilgidrolaza (OAH) oqsillarining genom bo'ylab silika tahlilini oqsil-oqsil BLAST vositasi (BLASTp 2.15.0+) yordamida o'tkazdik (Altschul va boshqalar, 1997, 2005). Qisqacha aytganda, biz S. sclerotiorumdagi gomologik oqsilni xaritalash uchun so'rov ketma-ketligi sifatida Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank kirish raqami XP_040799428.1; 342 aminokislotalar) va Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank kirish raqami XP_056833920.1; 316 aminokislotalar) dan foydalandik. BLASTp Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi (NCBI) veb-saytidagi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) GenBankdagi eng so'nggi mavjud bo'lgan S. sclerotiorum genom ma'lumotlariga qarshi amalga oshirildi.
Bundan tashqari, S. sclerotiorum dan bashorat qilingan OAH geni (SsOAH) va A. fijiensis CBS 313.89 dan AfOAH va P. lagena dan PlOAH ning evolyutsion tahlili va filogenetik daraxti MEGA11 (Tamura va boshqalar, 2021) da maksimal ehtimollik usuli va JTT matritsaga asoslangan model (Jones va boshqalar, 1992) yordamida aniqlandi. Filogenetik daraxt S. sclerotiorum dan bashorat qilingan barcha OAH genlarining (SsOAH) oqsil ketma-ketliklarining ko'p qirrali hizalanish tahlili va Cheklovga asoslangan hizalanish vositasi (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) yordamida so'rov ketma-ketligi bilan birlashtirildi (Papadopoulos va Agarwala, 2007). Bundan tashqari, S. sclerotiorum dan olingan SsOAH ning eng yaxshi mos keladigan aminokislotalar ketma-ketliklari ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) yordamida so'rovlar ketma-ketliklari (AfOAH va PlOAH) bilan hizalandi (Larkin va boshqalar, 2007) va hizalanishdagi saqlangan mintaqalar ESPript vositasi (3.0 versiyasi; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) yordamida vizualizatsiya qilindi.
Bundan tashqari, S. sclerotiorum SsOAH ning bashorat qilingan funktsional vakillik domenlari va saqlangan joylari InterPro vositasi (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) yordamida turli oilalarga interaktiv ravishda tasniflandi (Blum va boshqalar, 2021). Nihoyat, bashorat qilingan S. sclerotiorum SsOAH ning uch o'lchovli (3D) strukturaviy modellashtirish Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley va boshqalar, 2015) yordamida amalga oshirildi va SWISS-MODEL serveri (https://swissmodel.expasy.org/) yordamida tasdiqlandi (Biasini va boshqalar, 2014). Bashorat qilingan uch o'lchovli tuzilmalar (PDB formati) UCSF-Chimera paketi (1.15 versiyasi; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) yordamida interaktiv ravishda vizualizatsiya qilindi (Pettersen va boshqalar, 2004).
Sclerotinia sclerotiorum mitseliyasida oksaloatsetat asetilgidrolaza (SsOAH; GenBank kirish raqami: XM_001590428.1) ning transkripsiya darajasini aniqlash uchun miqdoriy real vaqtda lyuminestsent PZR qo'llanildi. Qisqacha aytganda, S. sclerotiorum PDB solingan kolbaga emlandi va mitseliya o'sishini rag'batlantirish uchun 25 ± 2 °C da 24 soat davomida 150 rpm tezlikda va doimiy qorong'ilikda (24 soat) chayqatish inkubatoriga joylashtirildi (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, AQSh). Shundan so'ng, hujayralar oxirgi IC50 konsentratsiyalarida (mos ravishda taxminan 40 va 3,2 mg/L) L-ornitin va Rizolex-T fungitsid bilan ishlov berildi va keyin xuddi shu sharoitlarda yana 24 soat davomida kultivatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, kulturalar 2500 rpm tezlikda 5 daqiqa davomida santrifuga qilindi va supernatant (zamburug'li mitseliy) gen ekspressiyasini tahlil qilish uchun to'plandi. Xuddi shunday, zamburug'li mitseliy infektsiyadan keyin 0, 24, 48, 72, 96 va 120 soat ichida infektsiyalangan to'qimalar yuzasida oq mog'or va paxtasimon mitseliy hosil qilgan infektsiyalangan o'simliklardan to'plandi. RNK zamburug'li mitseliydan ajratib olindi va keyin yuqorida tavsiflanganidek kDNK sintez qilindi. SsOAH uchun primer ketma-ketliklari S3 qo'shimcha jadvalida keltirilgan. SsActin (GenBank kirish raqami: XM_001589919.1) uy xo'jaligi geni sifatida ishlatilgan va nisbiy gen ekspressiyasi 2-ΔΔCT usuli yordamida hisoblab chiqilgan (Livak va Schmittgen, 2001).
Oksalat kislotasi kartoshka dekstroza bulonida (PDB) va Sclerotinia sclerotiorum zamburug'li patogenni o'z ichiga olgan o'simlik namunalarida Xu va Zhang (2000) usuliga ko'ra ozgina o'zgartirishlar bilan aniqlandi. Qisqacha aytganda, S. sclerotiorum izolatlari PDB solingan kolbalarga emlandi va keyin mitseliy o'sishini rag'batlantirish uchun chayqatish inkubatorida (I2400 modeli, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, AQSh) 150 rpm tezlikda 25 ± 2 °C da 3-5 kun davomida doimiy qorong'ilikda (24 soat) kultivatsiya qilindi. Inkubatsiyadan so'ng, qo'ziqorin kulturasi avval Whatman #1 filtr qog'ozidan filtrlandi va keyin qoldiq mitseliyni olib tashlash uchun 2500 rpm tezlikda 5 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Supernatant to'plandi va oksalatni keyingi miqdoriy aniqlash uchun 4°C da saqlandi. O'simlik namunalarini tayyorlash uchun taxminan 0,1 g o'simlik to'qimasi bo'laklari distillangan suv bilan uch marta (har safar 2 ml) ekstraksiya qilindi. Keyin namunalar 2500 rpm tezlikda 5 daqiqa davomida santrifugaga solindi, supernatant Whatman №1 filtr qog'ozi orqali quruq filtrlandi va keyingi tahlil uchun yig'ildi.
Oksalat kislotasining miqdoriy tahlili uchun reaksiya aralashmasi shisha tiqinli naychada quyidagi tartibda tayyorlandi: 0,2 ml namuna (yoki PDB kulturasi filtrati yoki oksalat kislotasining standart eritmasi), 0,11 ml bromofenol ko'k (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pitsburg, PA, AQSh), 0,198 ml 1 M sulfat kislota (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qohira, Misr) va 0,176 ml 100 mM kaliy dikromati (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, AQSh), so'ngra eritma distillangan suv bilan 4,8 ml gacha suyultirildi, kuchli aralashtirildi va darhol 60 °C suv hammomiga joylashtirildi. 10 daqiqadan so'ng reaksiya 0,5 ml natriy gidroksid eritmasi (NaOH; 0,75 M) qo'shilishi bilan to'xtatildi. Reaksiya aralashmasining absorbsiyasi (A600) 600 nm da UV-160 spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) yordamida o'lchandi. Madaniy filtratlar va o'simlik namunalarini miqdoriy aniqlash uchun mos ravishda PDB va distillangan suv nazorat sifatida ishlatilgan. Madaniy filtratlardagi oksalat kislotasi konsentratsiyasi, PDB muhitining millilitriga oksalat kislotasining mikrogrammlari (μg.mL−1) sifatida ifodalangan va barg ekstraktlaridagi oksalat kislotasi konsentratsiyasi, yangi og'irlikdagi grammga oksalat kislotasining mikrogrammlari (μg.g−1 FW) sifatida ifodalangan, oksalat kislotasi kalibrlash egri chizig'i (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, AQSh) yordamida aniqlandi.
Tadqiqot davomida barcha tajribalar, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, har bir ishlov berish uchun oltita biologik replikatsiya va har bir biologik replikatsiya uchun beshta idish (har bir idishda ikkita o'simlik) bilan to'liq tasodifiy dizaynda (CRD) ishlab chiqilgan. Biologik replikalar ikki nusxada tahlil qilindi (ikkita texnik replika). Texnik replikalar bir xil tajribaning takrorlanuvchanligini tekshirish uchun ishlatilgan, ammo soxta replikatsiyalardan qochish uchun statistik tahlilda ishlatilmagan. Ma'lumotlar statistik jihatdan dispersiya tahlili (ANOVA) va undan keyin Tukey-Kramerning jiddiy farq (HSD) testi (p ≤ 0,05) yordamida tahlil qilindi. In vitro tajribalar uchun IC50 va IC99 qiymatlari probit modeli yordamida hisoblab chiqildi va 95% ishonch intervallari hisoblab chiqildi.
Misrning El-G'abiya gubernatorligidagi turli soya dalalaridan jami to'rtta izolat to'plandi. PDA muhitida barcha izolatlar kremsimon oq miselyumni hosil qildi, ular tezda paxtadek oq rangga aylandi (1A-rasm) va keyin sklerotiy bosqichida bej yoki jigarrang rangga aylandi. Sklerotiyalar odatda zich, qora, sharsimon yoki tartibsiz shaklda bo'ladi, uzunligi 5,2 dan 7,7 mm gacha va diametri 3,4 dan 5,3 mm gacha (1B-rasm). To'rtta izolat 25 ± 2 °C da 10-12 kunlik inkubatsiyadan so'ng madaniyat muhitining chetida sklerotiyaning chekka naqshini hosil qilgan bo'lsa-da (1A-rasm), ular orasida har bir plastinkadagi sklerotiyalar soni sezilarli darajada farq qildi (P < 0,001), 3-izolatda eng ko'p sklerotiyalar soni kuzatildi (har bir plastinkada 32,33 ± 1,53 sklerotiya; 1C-rasm). Xuddi shunday, 3-izolat PDBda boshqa izolatlarga qaraganda ko'proq oksalat kislotasini ishlab chiqardi (3,33 ± 0,49 mkg.mL−1; 1D-rasm). 3-izolat fitopatogen qo'ziqorin Sclerotinia sclerotiorum ning tipik morfologik va mikroskopik xususiyatlarini ko'rsatdi. Masalan, PDAda 3-izolat koloniyalari tez o'sdi, kremsi oq rangga ega edi (1A-rasm), teskari bej yoki och losos sariq-jigarrang rangga ega edi va 9 sm diametrli plastinka yuzasini to'liq qoplash uchun 25 ± 2°C da 6-7 kun kerak bo'ldi. Yuqoridagi morfologik va mikroskopik xususiyatlarga asoslanib, 3-izolat Sclerotinia sclerotiorum sifatida aniqlandi.
1-rasm. Keng tarqalgan dukkakli ekinlardan olingan S. sclerotiorum izolatlarining xususiyatlari va patogenligi. (A) PDA muhitida to'rtta S. sclerotiorum izolatlarining mitseliy o'sishi, (B) to'rtta S. sclerotiorum izolatlarining sklerotiyasi, (C) sklerotiyalar soni (har bir plastinkada), (D) PDB muhitida oksalat kislotasi sekretsiyasi (μg.mL−1) va (E) issiqxona sharoitida sezgir tijorat dukkakli o'simlik navi Giza 3 da to'rtta S. sclerotiorum izolatlarining kasallik og'irligi (%). Qiymatlar beshta biologik replikatsiyaning o'rtacha ± SD qiymatini ifodalaydi (n = 5). Turli harflar davolash usullari orasidagi statistik jihatdan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (p < 0,05). (F–H) Oq mog'orning odatiy belgilari mos ravishda 3-izolat (dpi) bilan emlanganidan 10 kun o'tgach, yer usti poyalari va silikalarida paydo bo'ldi. (I) S. sclerotiorum izolyati #3 ning ichki transkripsiyalangan spacer (ITS) mintaqasining evolyutsion tahlili maksimal ehtimollik usuli yordamida amalga oshirildi va Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi (NCBI) ma'lumotlar bazasidan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) olingan 20 ta mos yozuvlar izolyati/shtammlari bilan taqqoslandi. Klasterlash chiziqlari ustidagi raqamlar mintaqani qoplashni (%), klasterlash chiziqlari ostidagi raqamlar esa shox uzunligini ko'rsatadi.
Bundan tashqari, patogenlikni tasdiqlash uchun olingan to'rtta S. sclerotiorum izolatlari sezgir tijorat loviya navi Giza 3 ni issiqxona sharoitida emlash uchun ishlatilgan, bu Koch postulatlariga mos keladi (1E-rasm). Olingan barcha qo'ziqorin izolatlari patogen bo'lib, yashil loviyani yuqtirishi mumkin bo'lsa-da (Giza 3 ga qarang), emlashdan 10 kun o'tgach (dpi) barcha yer usti qismlarida (1F-rasm), ayniqsa poyalarda (1G-rasm) va dukkaklarda (1H-rasm) odatiy oq mog'or alomatlarini keltirib chiqarishi mumkin bo'lsa-da, 3-izolat ikkita mustaqil tajribada eng agressiv izolat bo'lgan. 3-izolat loviya o'simliklarida eng yuqori kasallik og'irligiga (%) ega edi (infektsiyadan 7, 14 va 21 kun o'tgach mos ravishda 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 va 76,7 ± 3,1; 1F-rasm).
Eng invaziv S. sclerotiorum izolyati #3 ning aniqlanishi ichki transkripsiyalangan spacer (ITS) ketma-ketligi asosida qo'shimcha tasdiqlandi (1I-rasm). 3-izolat va 20 ta mos yozuvlar izolyati/shtammlari o'rtasidagi filogenetik tahlil ular orasida yuqori o'xshashlikni (>99%) ko'rsatdi. Shuni ta'kidlash kerakki, S. sclerotiorum izolyati #3 (533 bp) quruq no'xat urug'laridan ajratilgan Amerika S. sclerotiorum izolyati LPM36 (GenBank kirish raqami MK896659.1; 540 bp) va Xitoy S. sclerotiorum izolyati YKY211 (GenBank kirish raqami OR206374.1; 548 bp) ga yuqori o'xshashlikka ega, bu esa binafsha (Matthiola incana) poyasining chirishiga olib keladi, ularning barchasi dendrogramning yuqori qismida alohida guruhlangan (1I-rasm). Yangi ketma-ketlik NCBI ma'lumotlar bazasiga joylashtirildi va “Sclerotinia sclerotiorum – izolat YN-25” (GenBank kirish raqami PV202792) deb nomlandi. Ko'rinib turibdiki, 3-izolat eng invaziv izolatdir; shuning uchun ushbu izolat keyingi barcha tajribalarda o'rganish uchun tanlangan.
Diamin L-ornitinning (Sigma-Aldrich, Darmshtadt, Germaniya) turli konsentratsiyalarda (12,5, 25, 50, 75, 100 va 125 mg/L) S. sclerotiorum izolyati 3 ga qarshi antibakterial faolligi in vitro sharoitida o'rganildi. Shunisi e'tiborga loyiqki, L-ornitin antibakterial ta'sir ko'rsatdi va S. sclerotiorum hyphae ning radial o'sishini dozaga bog'liq holda asta-sekin inhibe qildi (2A, B-rasm). Sinovdan o'tgan eng yuqori konsentratsiyada (125 mg/L) L-ornitin eng yuqori mitseliy o'sishini inhibe qilish tezligini (99,62 ± 0,27%; 2B-rasm) ko'rsatdi, bu sinovdan o'tgan eng yuqori konsentratsiyada (10 mg/L) tijorat fungitsid Rizolex-T ga teng edi (inhibisiya darajasi 99,45 ± 0,39%; 2C-rasm), bu o'xshash samaradorlikni ko'rsatadi.
2-rasm. L-ornitinning Sclerotinia sclerotiorum ga qarshi in vitro antibakterial faolligi. (A) L-ornitinning turli konsentratsiyalarining S. sclerotiorum ga qarshi antibakterial faolligini tijorat fungitsid Rizolex-T (10 mg/L) bilan taqqoslash. (B, C) Turli konsentratsiyali L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100 va 125 mg/L) yoki Rizolex-T (2, 4, 6, 8 va 10 mg/L) bilan ishlov berilgandan so'ng S. sclerotiorum mitselial o'sishining inhibisyon darajasi (%). Qiymatlar beshta biologik replikatsiyaning o'rtacha ± SD qiymatini ifodalaydi (n = 5). Turli harflar davolash usullari orasidagi statistik farqlarni bildiradi (p < 0,05). (D, E) Mos ravishda L-ornitin va tijorat fungitsid Rizolex-T ning probit modeli regressiya tahlili. Probit modelining regressiya chizig'i to'liq ko'k chiziq sifatida, ishonch oralig'i (95%) esa qizil chiziq sifatida ko'rsatilgan.
Bundan tashqari, probit regressiya tahlili o'tkazildi va tegishli grafiklar 1-jadval va 2D, E rasmlarda ko'rsatilgan. Qisqacha aytganda, L-ornitinning maqbul qiyalik qiymati (y = 2.92x − 4.67) va unga bog'liq muhim statistika (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 va p < 0.0001; 2D-rasm) tijorat fungitsid Rizolex-T bilan solishtirganda (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 va p < 0.0001) S. sclerotiorum ga qarshi antifungal faollikning kuchayganligini ko'rsatdi (1-jadval).
1-jadval. S. sclerotiorum ga qarshi L-ornitin va tijorat fungitsidi “Rizolex-T” ning yarim maksimal ingibitor konsentratsiyasi (IC50) va IC99 (mg/l) qiymatlari.
Umuman olganda, L-ornitin (250 mg/L) davolanmagan S. sclerotiorum bilan kasallangan o'simliklarga nisbatan davolangan oddiy loviya o'simliklarida oq mog'or rivojlanishi va og'irligini sezilarli darajada kamaytirdi (nazorat; 3A-rasm). Qisqacha aytganda, davolanmagan infektsiyalangan nazorat o'simliklarida kasallikning og'irligi asta-sekin oshgan bo'lsa-da (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 va 92.33 ± 3.06%), L-ornitin tajriba davomida kasallikning og'irligini (%) davolashdan keyin 7, 14 va 21 kundan keyin (dpt) mos ravishda sezilarli darajada kamaytirdi (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 va 26.36 ± 3.07) (3A-rasm). Xuddi shunday, S. sclerotiorum bilan kasallangan loviya o'simliklari 250 mg/L L-ornitin bilan ishlov berilganda, kasallikning rivojlanish egri chizig'i ostidagi maydon (AUDPC) davolanmagan nazorat guruhidagi 1274,33 ± 33,13 dan 281,03 ± 7,95 gacha kamaydi, bu musbat nazorat guruhidagi 50 mg/L Rizolex-T fungitsididan (183,61 ± 7,71; 3B-rasm) biroz pastroq edi. Ikkinchi tajribada ham xuddi shunday tendentsiya kuzatildi.
3-rasm. L-ornitinning ekzogen qo'llanilishining issiqxona sharoitida Sclerotinia sclerotiorum keltirib chiqaradigan oddiy loviya oq chirishining rivojlanishiga ta'siri. (A) 250 mg/L L-ornitin bilan ishlov berilgandan keyin oddiy loviya oq mog'orining kasallikning rivojlanish egri chizig'i. (B) L-ornitin bilan ishlov berilgandan keyin oddiy loviya oq mog'orining kasallikning rivojlanish egri chizig'i ostidagi maydon (AUDPC). Qiymatlar beshta biologik replikaning o'rtacha ± SD qiymatini ifodalaydi (n = 5). Turli harflar davolash usullari orasidagi statistik jihatdan ahamiyatli farqlarni bildiradi (p < 0,05).
250 mg/L L-ornitinning ekzogen qo'llanilishi 42 kundan keyin o'simlik balandligini (4A-rasm), har bir o'simlikdagi shoxlar sonini (4B-rasm) va har bir o'simlikdagi barglar sonini (4C-rasm) asta-sekin oshirdi. Rizolex-T tijorat fungitsid (50 mg/L) o'rganilgan barcha ozuqaviy parametrlarga eng katta ta'sir ko'rsatgan bo'lsa-da, 250 mg/L L-ornitinning ekzogen qo'llanilishi davolanmagan nazorat guruhiga nisbatan ikkinchi eng katta ta'sirga ega bo'ldi (4A-C-rasmlar). Boshqa tomondan, L-ornitin bilan ishlov berish fotosintetik pigmentlar xlorofill a (4D-rasm) va xlorofill b (4E-rasm) tarkibiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi, ammo salbiy nazorat (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) va musbat nazorat (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; 4F-rasm) bilan solishtirganda umumiy karotinoid miqdorini (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) biroz oshirdi. Umuman olganda, bu natijalar L-ornitin ishlov berilgan dukkaklilar uchun fitotoksik emasligini va hatto ularning o'sishini rag'batlantirishi mumkinligini ko'rsatadi.
4-rasm. Ekzogen L-ornitin qo'llanilishining issiqxona sharoitida Sclerotinia sclerotiorum bilan kasallangan loviya barglarining o'sish xususiyatlari va fotosintetik pigmentlariga ta'siri. (A) O'simlik balandligi (sm), (B) Har bir o'simlikdagi shoxlar soni, (C) Har bir o'simlikdagi barglar soni, (D) Xlorofill miqdori (mg g-1 fr og'irlik), (E) Xlorofill miqdori (mg g-1 fr og'irlik), (F) Umumiy karotinoid miqdori (mg g-1 fr og'irlik). Qiymatlar beshta biologik replikatsiyaning o'rtacha ± SD qiymatidir (n = 5). Turli harflar davolash usullari orasidagi statistik jihatdan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (p < 0,05).
Reaktiv kislorod turlarining (ROS; vodorod peroksid [H2O2] sifatida ifodalangan) va erkin radikallarning (superoksid anionlari [O2•−] sifatida ifodalangan) in situ gistokimyoviy lokalizatsiyasi shuni ko'rsatdiki, L-ornitinning (250 mg/L) ekzogen qo'llanilishi davolanmagan infeksiyalangan o'simliklarning (mos ravishda 173,31 ± 12,06 va 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) va 50 mg/L tijorat fungitsid Rizolex-T bilan ishlov berilgan o'simliklarning (mos ravishda 170,12 ± 9,50 va 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) to'planishiga nisbatan H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; 5A-rasm) va O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; 5B-rasm) to'planishini sezilarli darajada kamaytirdi. 72 soatda. HPT ostida yuqori darajadagi H2O2 va O2•− to'plangan (5A-rasm, B). Xuddi shunday, TCA asosidagi malondialdegid (MDA) tahlili shuni ko'rsatdiki, S. sclerotiorum bilan zararlangan loviya o'simliklari barglarida yuqori darajadagi MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) to'plagan (5C-rasm). Biroq, L-ornitinning ekzogen qo'llanilishi lipid peroksidlanishini sezilarli darajada kamaytirdi, bu ishlov berilgan o'simliklarda MDA miqdorining pasayishi (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt) bilan tasdiqlanadi.
5-rasm. Issiqxona sharoitida infeksiyadan keyin 72 soat o'tgach, S. sclerotiorum bilan kasallangan loviya barglarida oksidlovchi stressning asosiy markerlari va fermentativ bo'lmagan antioksidant himoya mexanizmlariga ekzogen L-ornitin qo'llanilishining ta'siri. (A) Vodorod peroksid (H2O2; nmol g−1 FW) 72 ot kuchida, (B) superoksid anioni (O2•−; nmol g−1 FW) 72 ot kuchida, (C) malondialdegid (MDA; nmol g−1 FW) 72 ot kuchida, (D) 72 ot kuchida umumiy eruvchan fenollar (mg GAE g−1 FW), (E) 72 ot kuchida umumiy eruvchan flavonoidlar (mg RE g−1 FW), (F) 72 ot kuchida umumiy erkin aminokislotalar (mg g−1 FW) va (G) 72 ot kuchida prolin miqdori (mg g−1 FW). Qiymatlar 5 ta biologik replikaning o'rtacha ± standart og'ishini (o'rtacha ± SD) ifodalaydi (n = 5). Turli harflar davolash usullari orasidagi statistik jihatdan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (p < 0,05).