Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS uchun cheklangan qo'llab-quvvatlash mavjud. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz namoyish qilamiz.
Yuqori yuklanish miqdoriga ega insulin nanopartikullari (NP) turli dozalash shakllarida turli xil qo'llanilishlarni topdi. Ushbu ish muzlatish va purkash bilan quritish jarayonlarining insulin bilan to'ldirilgan xitosan nanopartikullarining tuzilishiga ta'sirini baholashga qaratilgan, krioprotektor sifatida mannitol bilan yoki mannitolsiz. Shuningdek, biz ushbu nanopartikullarning sifatini ularni qayta eritish orqali baholadik. Suvsizlantirishdan oldin, xitosan/natriy tripolifosfat/insulin o'zaro bog'langan nanopartikullarining zarracha hajmi 318 nm ga optimallashtirildi, PDI 0,18 ga, kapsulalash samaradorligi 99,4% ga va yuklanish 25,01% ga teng edi. Qayta tiklashdan so'ng, mannitol ishlatmasdan muzlatish bilan quritish usuli bilan ishlab chiqarilganlardan tashqari barcha nanopartikullar o'zlarining sharsimon zarracha tuzilishini saqlab qolishdi. Ikkala purkash orqali quritilgan mannitol o'z ichiga olgan nanopartikullar bilan solishtirganda, mannitolsiz purkash bilan quritilgan nanopartikullar ham eng kichik o'rtacha zarracha hajmini (376 nm) va eng yuqori yuklanishni ko'rsatdi. (25,02%) tarkibida shunga o'xshash kapsulalash tezligi (98,7%) va PDI (0,20) quritish yoki muzlatish-quritish usullari bilan. Mannitolsiz purkash-quritish orqali quritilgan nanopartikullar insulinning eng tez ajralib chiqishiga va hujayralar tomonidan so'rilishning eng yuqori samaradorligiga olib keldi. Ushbu ish shuni ko'rsatadiki, purkash-quritish an'anaviy muzlatish-quritish usullariga nisbatan krioprotektorlarga ehtiyoj sezmasdan insulin nanopartikullarini suvsizlantirishi mumkin, bu esa katta yuklash qobiliyatini, past qo'shimcha talablarini va operatsion xarajatlarni sezilarli darajada oshiradi.
1922-yilda kashf etilganidan beri21,2,3, insulin va uning farmatsevtik preparatlari 1-toifa diabet (T1DM) va 2-toifa diabet (T1DM) bilan og'rigan bemorlarning hayotini saqlab qoldi. Biroq, yuqori molekulyar og'irlikdagi oqsil sifatidagi xususiyatlari tufayli insulin osongina agregatsiyalanadi, proteolitik fermentlar tomonidan parchalanadi va birinchi o'tish effekti bilan yo'q qilinadi. 1-toifa diabet tashxisi qo'yilgan odamlar umrining oxirigacha insulin in'ektsiyalariga muhtoj. Dastlab 2-toifa diabet tashxisi qo'yilgan ko'plab bemorlarga uzoq muddatli insulin in'ektsiyalari ham kerak. Kundalik insulin in'ektsiyalari bu shaxslar uchun kundalik og'riq va noqulaylikning jiddiy manbai bo'lib, ruhiy salomatlikka salbiy ta'sir ko'rsatadi. Natijada, og'iz orqali insulin yuborish kabi kamroq noqulaylik tug'diradigan insulin yuborishning boshqa shakllari keng o'rganilmoqda5, chunki ular butun dunyo bo'ylab taxminan 5 milliard diabetga chalingan odamning hayot sifatini tiklash salohiyatiga ega.
Nanopartikulyar texnologiya og'iz orqali insulin qabul qilish urinishlarida sezilarli yutuqlarga erishdi4,6,7. Insulinni tananing ma'lum joylariga maqsadli yetkazib berish uchun parchalanishdan samarali ravishda kapsulalashtiradi va himoya qiladi. Biroq, nanopartikulyar formulalardan foydalanish bir qator cheklovlarga ega, asosan zarrachalar suspenziyalarining barqarorlik muammolari tufayli. Saqlash paytida ba'zi agregatsiyalar yuz berishi mumkin, bu esa insulin bilan to'ldirilgan nanopartikullarning bio-mavjudligini pasaytiradi8. Bundan tashqari, insulin nanopartikullarining (NP) barqarorligini ta'minlash uchun nanopartikullar va insulin polimer matritsasining kimyoviy barqarorligini ham hisobga olish kerak. Hozirgi vaqtda muzlatib quritish texnologiyasi saqlash paytida kiruvchi o'zgarishlarning oldini olish bilan birga barqaror NPlarni yaratish uchun oltin standart hisoblanadi9.
Biroq, muzlatib quritish NPlarning sharsimon tuzilishiga muz kristallarining mexanik kuchlanishi ta'sir qilishining oldini olish uchun krioprotektorlarni qo'shishni talab qiladi. Bu liofilizatsiyadan keyin insulin nanopartikullarining yuklanishini sezilarli darajada kamaytiradi, chunki krioprotektor og'irlik nisbatining katta qismini egallaydi. Shuning uchun, ishlab chiqarilgan insulin NPlari ko'pincha insulinning terapevtik oynasiga erishish uchun ko'p miqdorda quruq nanopartikullarga ehtiyoj borligi sababli, og'iz orqali qabul qilinadigan tabletkalar va og'iz orqali qabul qilinadigan plyonkalar kabi quruq kukunli formulalarni ishlab chiqarish uchun yaroqsiz deb topiladi.
Purkagich bilan quritish farmatsevtika sanoatida suyuq fazalardan quruq kukunlar ishlab chiqarish uchun taniqli va arzon sanoat miqyosidagi jarayondir10,11. Zarrachalar hosil bo'lish jarayonini nazorat qilish bir nechta bioaktiv birikmalarni to'g'ri kapsulalash imkonini beradi12,13. Bundan tashqari, u og'iz orqali qabul qilish uchun kapsulalangan oqsillarni tayyorlashning samarali usuliga aylandi. Purkagich bilan quritish paytida suv juda tez bug'lanadi, bu zarracha yadrosining haroratini past darajada ushlab turishga yordam beradi11,14, bu esa uni issiqlikka sezgir komponentlarni kapsulalash uchun qo'llash imkonini beradi. Purkagich bilan quritishdan oldin, qoplama materiali kapsulalangan ingredientlarni o'z ichiga olgan eritma bilan yaxshilab gomogenlashtirilishi kerak11,14. Muzlatish bilan quritishdan farqli o'laroq, purkagich bilan quritishda kapsulalashdan oldin gomogenizatsiya suvsizlanish paytida kapsulalash samaradorligini oshiradi. Purkagich bilan quritish kapsulalash jarayoni krioprotektorlarni talab qilmagani uchun, yuqori yuklanish miqdoriga ega quritilgan NPlarni ishlab chiqarish uchun purkagich bilan quritishdan foydalanish mumkin.
Ushbu tadqiqotda ion gel usuli yordamida xitosan va natriy tripolifosfatni o'zaro bog'lash orqali insulin bilan to'ldirilgan NPlarni ishlab chiqarish haqida xabar berilgan. Ion gelatsiyasi - bu ma'lum sharoitlarda ikki yoki undan ortiq ion turlari o'rtasidagi elektrostatik o'zaro ta'sirlar orqali nanopartikullarni ishlab chiqarish imkonini beruvchi tayyorlash usuli. Optimallashtirilgan xitosan/natriy tripolifosfat/insulin o'zaro bog'langan nanopartikullarni suvsizlantirish uchun muzlatish va purkash bilan quritish usullari qo'llanildi. Suvsizlantirishdan so'ng, ularning morfologiyasi SEM yordamida tahlil qilindi. Ularning rekombinatsiya qobiliyati ularning o'lcham taqsimoti, sirt zaryadi, PDI, kapsulalash samaradorligi va yuklanish tarkibini o'lchash orqali baholandi. Turli xil suvsizlantirish usullari bilan ishlab chiqarilgan qayta eriydigan nanopartikullarning sifati, shuningdek, ularning insulin himoyasi, ajralib chiqish xususiyati va hujayralarni qabul qilish samaradorligini taqqoslash orqali baholandi.
Aralash eritmaning pH qiymati va xitosan va insulin nisbati yakuniy NPlarning zarrachalar hajmi va kapsulalash samaradorligiga (EE) ta'sir qiluvchi ikkita asosiy omil bo'lib, ular ionotropik gelatsiya jarayoniga bevosita ta'sir qiladi. Aralash eritmaning pH qiymati zarrachalar hajmi va kapsulalash samaradorligi bilan yuqori darajada bog'liqligi ko'rsatildi (1a-rasm). 1a-rasmda ko'rsatilganidek, pH 4,0 dan 6,0 gacha oshishi bilan o'rtacha zarrachalar hajmi (nm) kamaydi va EE sezilarli darajada oshdi, pH 6,5 ga oshganda esa o'rtacha zarrachalar hajmi osha boshladi va EE o'zgarishsiz qoldi. Xitosanning insulinga nisbati oshishi bilan o'rtacha zarrachalar hajmi ham oshadi. Bundan tashqari, nanopartikullar xitosan/insulinning massa nisbati 2,5:1 dan (w/w) yuqori bo'lganda tayyorlanganda EE da hech qanday o'zgarish kuzatilmadi (1b-rasm). Shuning uchun, ushbu tadqiqotda optimal tayyorlash sharoitlari (pH 6,0, xitosan/insulin massa nisbati 2,5:1) insulin bilan to'ldirilgan nanopartikullarni keyingi tadqiqotlar uchun tayyorlash uchun ishlatilgan. Ushbu tayyorlash sharti ostida insulin nanopartikullarining o'rtacha zarracha hajmi 318 nm ga optimallashtirilgan (1c-rasm), PDI 0,18, joylashtirish samaradorligi 99,4%, zeta potensiali 9,8 mv va insulin yuklanishi 25,01% (m/m) ni tashkil etdi. Transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) natijalariga asoslanib, optimallashtirilgan nanopartikullar taxminan sharsimon va diskret bo'lib, nisbatan bir xil o'lchamga ega edi (1d-rasm).
Insulin nanopartikullarini parametrlarni optimallashtirish: (a) pH ning insulin nanopartikullarining o'rtacha diametri va kapsulalash samaradorligiga (EE) ta'siri (xitosan va insulinning 5:1 massa nisbatida tayyorlangan); (b) xitosan va insulin massa nisbatining insulin NPlarining o'rtacha diametri va kapsulalash samaradorligiga (EE) ta'siri (pH 6 da tayyorlangan); (c) optimallashtirilgan insulin nanopartikullarining zarracha hajmining taqsimlanishi; (d) optimallashtirilgan insulin NPlarining TEM mikrografiyasi.
Ma'lumki, xitosan pKa qiymati 6,5 ga teng bo'lgan kuchsiz polielektrolitdir. Uning asosiy aminokislota guruhi vodorod ionlari bilan protonlanganligi sababli, u kislotali muhitda musbat zaryadlangan15. Shuning uchun u ko'pincha manfiy zaryadlangan makromolekulalarni kapsulalash uchun tashuvchi sifatida ishlatiladi. Ushbu tadqiqotda xitosan 5,3 izoelektrik nuqtaga ega insulinni kapsulalash uchun ishlatilgan. Xitosan qoplama materiali sifatida ishlatilganligi sababli, uning nisbati oshishi bilan nanopartikullarning tashqi qatlamining qalinligi mos ravishda oshadi, bu esa o'rtacha zarracha hajmining kattalashishiga olib keladi. Bundan tashqari, xitosanning yuqori darajasi ko'proq insulinni kapsulalashi mumkin. Bizning holatimizda, xitosan va insulin nisbati 2,5:1 ga yetganda EE eng yuqori bo'lgan va nisbat oshib borgan sari EE da sezilarli o'zgarish bo'lmagan.
Xitosan va insulin nisbatidan tashqari, pH ham NPlarni tayyorlashda muhim rol o'ynadi. Gan va boshqalar 17 xitosan nanopartikullarining zarrachalar hajmiga pH ning ta'sirini o'rganishdi. Ular pH 6,0 ga yetguncha zarrachalar hajmining doimiy ravishda kamayishini aniqladilar va pH > 6,0 da zarrachalar hajmining sezilarli darajada oshishi kuzatildi, bu bizning kuzatishlarimizga mos keladi. Bu hodisa pH ning oshishi bilan insulin molekulasi manfiy sirt zaryadiga ega bo'lishi va shu bilan xitosan/natriy tripolifosfat (TPP) kompleksi bilan elektrostatik o'zaro ta'sirga ega bo'lishi, natijada kichik zarrachalar hajmi va yuqori EE ga olib kelishi bilan bog'liq. Biroq, pH 6,5 ga sozlanganda, xitosandagi aminokislotalar deprotonatsiya qilindi, natijada xitosan katlanmasi paydo bo'ldi. Shunday qilib, yuqori pH aminokislotalarning TPP va insulinga kamroq ta'sir qilishiga olib keladi, natijada o'zaro bog'lanish pastroq, o'rtacha zarrachalar hajmi kattaroq va EE pastroq bo'ladi.
Muzlatib quritilgan va purkagich bilan quritilgan NPlarning morfologik xususiyatlarini tahlil qilish yaxshiroq suvsizlantirish va kukun hosil qilish usullarini tanlashga yo'l ko'rsatishi mumkin. Afzal ko'rilgan usul preparatning barqarorligini, zarrachalarning bir xil shaklini, preparatning yuqori yuklanishini va asl eritmada yaxshi eruvchanlikni ta'minlashi kerak. Ushbu tadqiqotda, ikkita usulni yaxshiroq taqqoslash uchun, suvsizlantirish paytida 1% mannitolli yoki mannitolsiz insulin NPlari ishlatilgan. Mannitol muzlatib quritish va purkagich bilan quritish uchun turli xil quruq kukun formulalarida hajmlashtiruvchi vosita yoki krioprotektor sifatida ishlatiladi. 2a-rasmda ko'rsatilganidek, mannitolsiz liofilizatsiyalangan insulin nanopartikullari uchun skanerlash elektron mikroskopi (SEM) ostida katta, tartibsiz va qo'pol sirtlarga ega yuqori g'ovakli kukun tuzilishi kuzatildi. Suvsizlantirishdan keyin kukunda bir nechta diskret zarrachalar aniqlandi (2e-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, ko'pgina NPlar muzlatib quritish paytida hech qanday krioprotektorsiz parchalangan. 1% mannitolni o'z ichiga olgan muzlatib quritilgan va purkagich bilan quritilgan insulin nanopartikullari uchun silliq sirtlarga ega sharsimon nanopartikullar kuzatildi (1-rasm). 2b,d,f,h). Mannitolsiz purkash bilan quritilgan insulin nanopartikullari sharsimon bo'lib qoldi, ammo yuzasida ajinlar paydo bo'ldi (2c-rasm). Sferik va ajinlangan yuzalar quyida ajralib chiqish xususiyati va hujayralarni qabul qilish sinovlarida batafsilroq muhokama qilinadi. Quritilgan NPlarning ko'rinadigan ko'rinishiga asoslanib, mannitolsiz purkash bilan quritilgan NPlar ham, mannitol bilan muzlatib quritilgan va purkash bilan quritilgan NPlar ham mayda NP kukunlarini hosil qildi (2f,g,h-rasm). Zarrachalar yuzalari orasidagi sirt maydoni qanchalik katta bo'lsa, eruvchanlik shunchalik yuqori bo'ladi va shuning uchun ajralib chiqish tezligi ham shuncha yuqori bo'ladi.
Turli xil suvsizlangan insulin NPlarining morfologiyasi: (a) Mannitolsiz liofilizatsiyalangan insulin NPlarining SEM tasviri; (b) Mannitolli liofilizatsiyalangan insulin NPlarining SEM tasviri; (c) Mannitolsiz purkash bilan quritilgan insulin NPlarining SEM tasviri; (d) Mannitol bilan purkash bilan quritilgan insulin NPlarining SEM tasviri; (e) Mannitolsiz liofilizatsiyalangan insulin NPlarining kukuni tasviri; (f) Mannitolli liofilizatsiyalangan insulin NPlarining tasviri; (g) Mannitolsiz purkash bilan quritilgan insulin NPlarining tasviri; (h) Mannitolli purkash bilan quritilgan insulin NPlarining tasviri.
Muzlatib quritish paytida mannitol krioprotektor vazifasini bajaradi, NPlarni amorf shaklda saqlaydi va muz kristallari bilan shikastlanishining oldini oladi19. Aksincha, purkash bilan quritish paytida muzlatish bosqichi yo'q. Shuning uchun bu usulda mannitol talab qilinmaydi. Aslida, mannitolsiz purkash bilan quritilgan NPlar avval tasvirlanganidek nozikroq NPlarni berdi. Biroq, mannitol purkash bilan quritish jarayonida NPlarga yanada sharsimon tuzilish berish uchun plomba vazifasini bajarishi mumkin20 (2d-rasm), bu esa bunday kapsulalangan NPlarning bir xil ajralib chiqish xususiyatiga erishishga yordam beradi. Bundan tashqari, ba'zi yirik zarrachalarni mannitolni o'z ichiga olgan muzlatib quritilgan va purkash bilan quritilgan insulin NPlarida aniqlash mumkinligi aniq (2b, d-rasm), bu zarracha yadrosida kapsulalangan insulin bilan birga mannitolning to'planishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Xitosan qatlamiga. Shuni ta'kidlash kerakki, ushbu tadqiqotda, suvsizlanishdan keyin sharsimon tuzilishning butunligini ta'minlash uchun mannitol va xitosan nisbati 5:1 da saqlanadi, shunda ko'p miqdordagi plomba moddasi quritilgan NPlarning zarracha hajmini ham kattalashtirishi mumkin.
Furye transformatsiyalangan infraqizil susaytirilgan to'liq aks ettirish (FTIR-ATR) spektroskopiyasi erkin insulin, xitosan, xitosan, TPP va insulinning fizik aralashmasini tavsifladi. Barcha suvsizlangan NPlar FTIR-ATR spektroskopiyasi yordamida tavsiflandi. Shunisi e'tiborga loyiqki, mannitol bilan muzlatib quritilgan kapsulalangan NPlarda va mannitol bilan va mannitolsiz purkash orqali quritilgan NPlarda 1641, 1543 va 1412 sm-1 diapazon intensivligi kuzatildi (3-rasm). Avval xabar qilinganidek, kuchning bu oshishi xitosan, TPP va insulin o'rtasidagi o'zaro bog'liqlik bilan bog'liq edi. Xitosan va insulin o'rtasidagi o'zaro ta'sirni o'rganish shuni ko'rsatdiki, insulin bilan to'ldirilgan xitosan nanopartikullarining FTIR spektrlarida xitosan tasmasi insulin tasmasi bilan bir-biriga mos keladi va karbonil intensivligini (1641 sm-1) va amin (1543 sm-1) kamarini oshiradi. TPP ning tripolifosfat guruhlari xitosandagi ammoniy guruhlari bilan bog'langan, 1412 sm-1 da tasma hosil qiladi.
Turli usullar bilan quritilgan erkin insulin, xitosan, xitosan/TPP/insulinning fizik aralashmalari va NPlarning FTIR-ATR spektrlari.
Bundan tashqari, bu natijalar SEMda ko'rsatilgan natijalarga mos keladi, ular kapsulalangan NPlar mannitol bilan purkalganda ham, muzlatib quritilganda ham butunligini saqlab qolganligini, ammo mannitol bo'lmaganda, faqat purkash orqali quritish kapsulalangan zarrachalarni hosil qilganligini ko'rsatdi. Aksincha, mannitolsiz muzlatib quritilgan NPlarning FTIR-ATR spektral natijalari xitosan, TPP va insulinning fizik aralashmasiga juda o'xshash edi. Bu natija shuni ko'rsatadiki, xitosan, TPP va insulin o'rtasidagi o'zaro bog'liqliklar endi mannitolsiz muzlatib quritilgan NPlarda mavjud emas. NPlar tuzilishi krioprotektorsiz muzlatib quritish paytida yo'q qilindi, buni SEM natijalarida ko'rish mumkin (2a-rasm). Suvsizlangan insulin NPlarining morfologiyasi va FTIR natijalariga asoslanib, mannitolsiz NPlarning parchalanishi tufayli qayta tiklash tajribalari va mannitolsiz NPlar uchun faqat liofilizatsiya qilingan, purkash orqali quritilgan va mannitolsiz NPlar ishlatilgan. suvsizlanish. muhokama qilish.
Dehidratsiya uzoq muddatli saqlash va boshqa formulalarga qayta ishlash uchun ishlatiladi. Quruq NPlarning saqlashdan keyin qayta tiklanish qobiliyati ularni tabletkalar va plyonkalar kabi turli formulalarda qo'llash uchun juda muhimdir. Biz mannitolsiz purkash bilan quritilgan insulin NPlarining o'rtacha zarracha hajmi qayta tiklangandan keyin biroz oshganini payqadik. Boshqa tomondan, purkash bilan quritilgan va muzlatib quritilgan insulin nanopartikullarining zarracha hajmi mannitol bilan sezilarli darajada oshdi (1-jadval). Ushbu tadqiqotda barcha NPlarni rekombinatsiya qilgandan so'ng PDI va EE sezilarli darajada o'zgarmadi (p > 0,05) (1-jadval). Bu natija shuni ko'rsatadiki, zarrachalarning aksariyati qayta eritilgandan keyin butunligicha qoldi. Biroq, mannitol qo'shilishi liofilizatsiya qilingan va purkash bilan quritilgan mannitol nanopartikullarining insulin yuklanishini sezilarli darajada kamaytirdi (1-jadval). Aksincha, mannitolsiz purkash bilan quritilgan NPlarning insulin yuklanish miqdori avvalgidek qoldi (1-jadval).
Ma'lumki, dori vositalarini yetkazib berish maqsadlarida foydalanilganda nanopartikullarning yuklanishi juda muhim. Kam yuklanishli NPlar uchun terapevtik chegaraga erishish uchun juda ko'p miqdorda material talab qilinadi. Biroq, bunday yuqori NP konsentratsiyasining yuqori yopishqoqligi og'iz orqali qabul qilishda va in'ektsiya formulalarida mos ravishda noqulaylik va qiyinchiliklarga olib keladi 22. Bundan tashqari, insulin NPlari tabletkalar va yopishqoq bioplyonkalar tayyorlash uchun ham ishlatilishi mumkin 23, 24, bu esa past yuklanish darajalarida ko'p miqdordagi NPlardan foydalanishni talab qiladi, natijada og'iz orqali qo'llash uchun mos bo'lmagan katta tabletkalar va qalin bioplyonkalar paydo bo'ladi. Shuning uchun, yuqori insulin yuklanishiga ega quritilgan NPlar juda istalgan. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, mannitolsiz purkagich bilan quritilgan NPlarning yuqori insulin yuklanishi ushbu muqobil yetkazib berish usullari uchun ko'plab jozibali afzalliklarni taqdim etishi mumkin.
Barcha quritilgan NPlar muzlatgichda uch oy davomida saqlandi.SEM natijalari shuni ko'rsatdiki, barcha quritilgan NPlarning morfologiyasi uch oylik saqlash davomida sezilarli darajada o'zgarmadi (4-rasm). Suvda qayta tiklangandan so'ng, barcha NPlar EE ning biroz pasayishini ko'rsatdi va uch oylik saqlash davrida taxminan oz miqdorda (~5%) insulin chiqardi (2-jadval). Biroq, barcha nanopartikullarning o'rtacha zarracha hajmi oshdi. Mannitolsiz purkash bilan quritilgan NPlarning zarracha hajmi 525 nm gacha oshdi, mannitol bilan purkash bilan quritilgan va muzlatib quritilgan NPlarning zarracha hajmi esa mos ravishda 872 va 921 nm gacha oshdi (2-jadval).
Uch oy davomida saqlangan turli xil suvsizlangan insulin NPlarining morfologiyasi: (a) Mannitolli liofilizatsiyalangan insulin NPlarining SEM tasviri; (b) Mannitolsiz purkash bilan quritilgan insulin nanopartikullarining SEM tasviri; (c) mannitolsiz purkash bilan quritilgan insulin NPlarining SEM tasvirlari.
Bundan tashqari, mannitol bilan purkash va muzlatish orqali quritilgan tiklangan insulin nanopartikullarida cho'kmalar kuzatildi (S2-rasm). Bunga katta zarrachalarning suvda to'g'ri suspenziyalanmaganligi sabab bo'lishi mumkin. Yuqoridagi barcha natijalar purkash orqali quritish texnikasi insulin nanopartikullarini suvsizlanishdan himoya qilishi mumkinligini va hech qanday plomba moddalari yoki krioprotektorlarsiz yuqori miqdorda insulin nanopartikullarini olish mumkinligini ko'rsatadi.
Insulinni ushlab turish pH = 2,5 muhitda pepsin, tripsin va α-ximotripsin bilan sinovdan o'tkazildi, bu NPlarning suvsizlanishdan keyin fermentativ hazm qilishga qarshi himoya qobiliyatini namoyish etdi. Suvsizlangan NPlarning insulinni ushlab turishi yangi tayyorlangan NPlar bilan taqqoslandi va erkin insulin salbiy nazorat sifatida ishlatildi. Ushbu tadqiqotda erkin insulin uchta fermentativ davolashda ham 4 soat ichida insulinning tez yo'q qilinishini ko'rsatdi (5a-c-rasm). Aksincha, mannitol bilan muzlatib quritilgan NPlarning va mannitol bilan yoki purkamasdan quritilgan NPlarning insulinni yo'q qilish sinovlari bu NPlarning fermentativ hazm qilishga qarshi sezilarli darajada yuqori himoyasini ko'rsatdi, bu yangi tayyorlangan insulin NPlariga o'xshash edi (1-rasm). 5a-c). Pepsin, tripsin va α-ximotripsindagi nanopartikullar yordamida mos ravishda 4 soat ichida insulinning 50%, 60% va 75% dan ortig'i himoya qilinishi mumkin edi (5a-c-rasm). Ushbu insulinni himoya qilish qobiliyati qon oqimiga insulinning yuqori singishi ehtimolini oshirishi mumkin25. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, mannitol bilan yoki mannitolsiz purkash va mannitol bilan muzlatib quritish suvsizlanishdan keyin NPlarning insulinni himoya qilish qobiliyatini saqlab qolishi mumkin.
Suvsizlangan insulin NPlarining himoyasi va ajralib chiqish xususiyati: (a) pepsin eritmasidagi insulinni himoya qilish; (b) tripsin eritmasidagi insulinni himoya qilish; (c) insulinni α-ximotripsin eritmasi bilan himoya qilish; (d) pH = 2,5 eritmada suvsizlangan NPlarning ajralib chiqish xususiyati; (e) pH = 6,6 eritmada suvsizlangan NPlarning ajralib chiqish xususiyati; (f) pH = 7,0 eritmada suvsizlangan NPlarning ajralib chiqish xususiyati.
Yangi tayyorlangan va tiklangan quruq insulin NPlari insulinning insulin qarshiligiga ta'sirini o'rganish uchun oshqozon, o'n ikki barmoqli ichak va yuqori ingichka ichakning pH muhitini simulyatsiya qilib, 37 °C da turli buferlarda (pH = 2.5, 6.6, 7.0) inkubatsiya qilindi. Turli muhitlarda ajralib chiqish xatti-harakati. Oshqozon-ichak traktining bo'lagi. pH = 2,5 da, insulin bilan to'ldirilgan NPlar va qayta erigan quruq insulin NPlari dastlabki bir soat ichida dastlabki portlash ajralib chiqishini, so'ngra keyingi 5 soat ichida sekin ajralib chiqishini ko'rsatdi (5d-rasm). Boshidagi bu tez ajralib chiqish, ehtimol, zarrachaning ichki tuzilishida to'liq immobilizatsiya qilinmagan oqsil molekulalarining tez sirt desorbsiyasi natijasidir. pH = 6,5 da, insulin bilan to'ldirilgan NPlar va qayta tiklangan quruq insulin NPlari 6 soat ichida silliq va sekin ajralib chiqishni ko'rsatdi, chunki sinov eritmasining pH qiymati NPlar tomonidan tayyorlangan eritmaning pH qiymatiga o'xshash edi (5e-rasm). pH = 7 da, NPlar beqaror edi va dastlabki ikki soat ichida deyarli butunlay parchalandi (5f-rasm). Buning sababi, xitosanning deprotonatsiyasi yuqori pH da sodir bo'ladi, bu esa kamroq ixcham polimer tarmog'iga va yuklangan insulinning ajralib chiqishiga olib keladi.
Bundan tashqari, mannitolsiz purkab quritilgan insulin NPlari boshqa quritilgan NPlarga qaraganda tezroq ajralib chiqish profilini ko'rsatdi (5d–f-rasm). Avval tasvirlanganidek, mannitolsiz quritilgan qayta tiklangan insulin NPlari eng kichik zarracha hajmini ko'rsatdi. Kichik zarrachalar kattaroq sirt maydonini ta'minlaydi, shuning uchun tegishli preparatning aksariyati zarracha yuzasida yoki uning yonida bo'ladi, bu esa preparatning tez ajralib chiqishiga olib keladi26.
NPlarning sitotoksikligi MTT tahlili yordamida tekshirildi. S4-rasmda ko'rsatilganidek, barcha suvsizlangan NPlar 50-500 mkg/ml konsentratsiyalarda hujayra hayotiyligiga sezilarli ta'sir ko'rsatmasligi aniqlandi, bu esa barcha suvsizlangan NPlardan terapevtik oynaga yetib borish uchun xavfsiz foydalanish mumkinligini ko'rsatadi.
Jigar insulin o'zining fiziologik funktsiyalarini bajaradigan asosiy organdir. HepG2 hujayralari - bu in vitro gepatotsitlarni qabul qilish modeli sifatida keng qo'llaniladigan inson gepatoma hujayra liniyasi. Bu yerda HepG2 hujayralari muzlatib quritish va purkash-quritish usullari yordamida quritilgan NPlarning hujayra ichidagi qabul qilinishini baholash uchun ishlatilgan. Oqim sitometriyasi va 25 mkg/ml konsentratsiyadagi erkin FITC insulin bilan bir necha soatlik inkubatsiyadan so'ng ko'rish orqali konfokal lazer skanerlash orqali hujayra ichidagi qabul qilish, yangi tayyorlangan FITC insulin bilan to'ldirilgan NPlar va teng insulin konsentratsiyalarida quritilgan FITC insulin bilan to'ldirilgan NPlar. Miqdoriy mikroskopiya (CLSM) kuzatuvlari o'tkazildi. Mannitolsiz liofilizatsiyalangan NPlar suvsizlanish paytida yo'q qilindi va bu sinovda baholanmadi. Yangi tayyorlangan insulin bilan to'ldirilgan NPlarning, mannitol bilan liofilizatsiyalangan NPlarning va mannitol bilan va mannitolsiz purkash-quritilgan NPlarning hujayra ichidagi floresans intensivligi (6a-rasm) 4,3 ni tashkil etdi, erkin insulinlarga qaraganda 2,6, 2,4 va 4,1 baravar yuqori. Mos ravishda FITC-insulin guruhi (6b-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, kapsulalangan insulin hujayra tomonidan erkin insulinga qaraganda ko'proq qabul qilinadi, bu asosan tadqiqotda ishlab chiqarilgan insulin bilan to'ldirilgan nanopartikullarning kichikroq hajmi tufayli.
Yangi tayyorlangan NPlar va suvsizlangan NPlar bilan 4 soatlik inkubatsiyadan so'ng HepG2 hujayralarining so'rilishi: (a) HepG2 hujayralari tomonidan FITC-insulin so'rilishining taqsimlanishi.(b) Oqim sitometriyasi yordamida tahlil qilingan floresans intensivligining geometrik o'rtacha qiymati (n = 3), *P < 0,05 erkin insulin bilan taqqoslaganda.
Xuddi shunday, CLSM tasvirlari shuni ko'rsatdiki, yangi tayyorlangan FITC-insulin bilan to'ldirilgan NPlar va FITC-insulin bilan to'ldirilgan purkagich bilan quritilgan NPlarning (mannitolsiz) FITC lyuminestsentsiya intensivligi boshqa namunalarnikiga qaraganda ancha kuchliroq edi (6a-rasm). Bundan tashqari, mannitol qo'shilishi bilan eritmaning yuqori yopishqoqligi hujayra tomonidan qabul qilinishiga qarshilikni oshirdi va natijada insulin proliferatsiyasi kamaydi. Bu natijalar mannitolsiz purkagich bilan quritilgan NPlar eng yuqori hujayra tomonidan qabul qilish samaradorligini namoyish etganligini ko'rsatadi, chunki ularning zarracha hajmi qayta eritilgandan keyin muzlatib quritilgan NPlarnikidan kichikroq edi.
Xitosan (o'rtacha molekulyar og'irligi 100 KDa, 75–85% deatsetillangan) Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada) dan sotib olindi. Natriy tripolifosfat (TPP) VWR (Radnor, Pensilvaniya, AQSh) dan sotib olindi. Ushbu tadqiqotda ishlatilgan rekombinant inson insulini Fisher Scientific (Waltham, MA, AQSh) dan olingan. Fluorescein izotiyosiyanat (FITC) bilan belgilangan inson insulini va 4′,6-diamidino-2-fenilindol digidroxlorid (DAPI) Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada) dan sotib olindi. HepG2 hujayra liniyasi ATCC (Manassas, Virjiniya, AQSh) dan olingan. Boshqa barcha reagentlar analitik yoki xromatografik darajaga ega edi.
1 mg/ml CS eritmasini 0,1% sirka kislotasi bo'lgan ikki marta distillangan suvda (DD suvi) eritib tayyorlang. 1 mg/ml TPP va insulin eritmalarini mos ravishda DD suvida va 0,1% sirka kislotasida eritib tayyorlang. Oldindan emulsiya politron PCU-2-110 yuqori tezlikdagi gomogenizator (Brinkmann Ind. Westbury, NY, AQSh) yordamida tayyorlandi. Tayyorlash jarayoni quyidagicha: birinchidan, 4 ml insulin eritmasiga 2 ml TPP eritmasi qo'shiladi va aralashma 30 daqiqa davomida aralashtiriladi va to'liq aralashtiriladi. Keyin, aralash eritma shprits orqali CS eritmasiga yuqori tezlikda aralashtirish (10 000 rpm) ostida tomchilab qo'shildi. Aralashmalar muzli hammomda 30 daqiqa davomida yuqori tezlikda aralashtirish (15 000 rpm) ostida saqlandi va o'zaro bog'langan insulin NPlarini olish uchun ma'lum bir pH qiymatiga moslashtirildi. Insulin NPlarining zarracha hajmini yanada gomogenlashtirish va kamaytirish uchun ular... zond tipidagi sonikatör (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germaniya) yordamida muzli vannada qo'shimcha 30 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov berildi.
Insulin NPSlari 25°C da DD suvida suyultirish orqali Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Avstriya) yordamida dinamik yorug'lik sochilishi (DLS) o'lchovlari yordamida Z-o'rtacha diametri, polidisperslik indeksi (PDI) va zeta potensiali uchun sinovdan o'tkazildi. Morfologiya va o'lcham taqsimoti Hitachi H7600 uzatish elektron mikroskopi (TEM) (Hitachi, Tokio, Yaponiya) yordamida tavsiflandi va keyinchalik tasvirlar Hitachi tasvirlash dasturi (Hitachi, Tokio, Yaponiya) yordamida tahlil qilindi. Insulin NPlarining kapsulalash samaradorligi (EE) va yuklash qobiliyatini (LC) baholash uchun NPlar 100 kDa molekulyar og'irlik chegarasi bo'lgan ultrafiltratsiya naychalariga pipetka bilan quyildi va 30 daqiqa davomida 500 xg da santrifuga qilindi. Filtratdagi kapsulalanmagan insulin to'rtlamchi nasosdan iborat Agilent 1100 seriyali HPLC tizimi (Agilent, Santa Clara, Kaliforniya, AQSh) yordamida miqdoriy jihatdan aniqlandi. avtosampler, ustunli isitgich va DAD detektori. Insulin C18 ustuni (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, AQSh) yordamida tahlil qilindi va 214 nm da aniqlandi. Ko'chma faza asetonitril va suvdan iborat bo'lib, tarkibida 0.1% TFA, gradient nisbati 10/90 dan 100/0 gacha bo'lgan va 10 daqiqa davomida ishlagan. Ko'chma faza 1.0 ml/min oqim tezligida pompalandi. Ustun harorati 20 °C ga o'rnatildi. (1) va (2) tenglamalar yordamida EE va LC foizlarini hisoblang.
Insulin NP ni optimallashtirish uchun 2,0 dan 4,0 gacha bo'lgan turli xil CS/insulin nisbatlari sinovdan o'tkazildi. Tayyorlash jarayonida turli miqdordagi CS eritmasi qo'shildi, shu bilan birga insulin/TPP aralashmasi doimiy ravishda saqlandi. Barcha eritmalar (insulin, TPP va CS) qo'shilgandan so'ng aralashmaning pH qiymatini diqqat bilan nazorat qilish orqali insulin NP lari 4,0 dan 6,5 gacha pH oralig'ida tayyorlandi. Insulin NP larining hosil bo'lishini optimallashtirish uchun insulin nanopartikullarining EE va zarracha hajmi turli pH qiymatlarida va CS/insulin massa nisbatlarida baholandi.
Optimallashtirilgan insulin NPlari alyuminiy idishga joylashtirildi va lenta bilan mahkamlangan salfetka bilan yopildi. Keyinchalik, vintli idishlar patnisli quritgich bilan jihozlangan Labconco FreeZone muzlatgich quritgichiga (Labconco, Kanzas-Siti, MO, AQSh) joylashtirildi. Quruq insulin NPlarini olish uchun harorat va vakuum bosimi dastlabki 2 soat uchun -10 °C, 0,350 Torr, 24 soatning qolgan 22 soati uchun esa 0 °C va 0,120 Torr darajasida o'rnatildi.
Kapsulalangan insulin ishlab chiqarish uchun Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Shveytsariya) ishlatilgan. Tanlangan quritish parametrlari: harorat 100 °C, ozuqa oqimi 3 L/min va gaz oqimi 4 L/min edi.
Suvsizlanishdan oldin va keyin insulin NPlari FTIR-ATR spektroskopiyasi yordamida tavsiflandi. Suvsizlangan nanopartikullar, shuningdek, erkin insulin va xitosan universal ATR namuna olish aksessuari (PerkinElmer, Waltham, Massachusets, AQSh) bilan jihozlangan Spectrum 100 FTIR spektrofotometri (PerkinElmer, Waltham, Massachusets, AQSh) yordamida tahlil qilindi. Signal o'rtacha ko'rsatkichlari 4000-600 sm2 chastota diapazonida 4 sm2 aniqlikda 16 ta skanerlashdan olindi.
Quruq insulin NPlarining morfologiyasi Helios NanoLab 650 Fokuslangan Ion Nurlarini Skanerlash Elektron Mikroskopi (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, AQSh) tomonidan olingan muzlatib quritilgan va purkab quritilgan insulin NPlarining SEM tasvirlari orqali baholandi. Foydalanilgan asosiy parametr 5 keV kuchlanish va 30 mA tok edi.
Barcha suvsizlangan insulin NPlari dd suvida qayta eritildi. Zarrachalar hajmi, PDI, EE va LC suvsizlangandan keyin ularning sifatini baholash uchun avval aytib o'tilgan usul yordamida yana sinovdan o'tkazildi. Angidroinsulin NPlarining barqarorligi, shuningdek, uzoq vaqt saqlangandan keyin NPlarning xususiyatlarini sinash orqali ham o'lchandi. Ushbu tadqiqotda suvsizlangandan keyin barcha NPlar muzlatgichda uch oy davomida saqlandi. Uch oylik saqlashdan so'ng, NPlar morfologik zarrachalar hajmi, PDI, EE va LC bo'yicha sinovdan o'tkazildi.
Suvsizlanishdan keyin NPlarni himoya qilishda insulinning samaradorligini baholash uchun 5 ml tiklangan NPlarni simulyatsiya qilingan oshqozon suyuqligi (pH 1.2, 1% pepsin saqlaydi), ichak suyuqligi (pH 6.8, 1% tripsin saqlaydi) yoki ximotripsin eritmasi (100 g/ml, fosfat buferida, pH 7.8) bo'lgan 45 ml da eriting. Ular 37°C da 100 rpm aralashtirish tezligida inkubatsiya qilindi. 500 mkl eritma turli vaqt nuqtalarida to'plandi va insulin konsentratsiyasi HPLC yordamida aniqlandi.
Yangi tayyorlangan va suvsizlangan insulin NPlarining in vitro ajralib chiqish xususiyati dializ paketi usuli bilan sinovdan o'tkazildi (molekulyar og'irlik chegarasi 100 kDa, Spectra Por Inc.). Yangi tayyorlangan va tiklangan quruq NPlar mos ravishda oshqozon, o'n ikki barmoqli ichak va yuqori ingichka ichakning pH muhitini simulyatsiya qilish uchun pH 2,5, pH 6,6 va pH 7,0 (0,1 M fosfat-buferlangan sho'r suv, PBS) suyuqliklarida dializ qilindi. Barcha namunalar 200 rpm tezlikda uzluksiz chayqatish bilan 37 °C da inkubatsiya qilindi. 5 ml dializ paketidan tashqaridagi suyuqlikni quyidagi vaqtlarda so'rib oling: 0,5, 1, 2, 3, 4 va 6 soat va darhol hajmni yangi dializat bilan to'ldiring. Suyuqlikdagi insulin ifloslanishi HPLC yordamida tahlil qilindi va nanopartikullardan insulin ajralib chiqish tezligi ajralib chiqqan erkin insulinning nanopartikullarga o'ralgan umumiy insulinga nisbatidan hisoblab chiqildi. (3-tenglama).
Inson gepatotsellyulyar karsinoma hujayra liniyasi HepG2 hujayralari 60 mm diametrli idishlarda 10% homila sigir zardobi, 100 IU/ml penitsillin va 100 mkg/ml streptomitsinni o'z ichiga olgan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) yordamida o'stirildi29. Kulturalar 37°C, 95% nisbiy namlik va 5% CO2 da saqlandi. Yutish tahlillari uchun HepG2 hujayralari 1 × 105 hujayra/ml da 8 quduqli Nunc Lab-Tek kamerali slayd tizimiga (Thermo Fisher, NY, AQSh) ekildi. Sitotoksiklik tahlillari uchun ular 96 quduqli plastinkalarga (Corning, NY, AQSh) 5 × 104 hujayra/ml zichlikda ekildi.
MTT tahlili yangi tayyorlangan va suvsizlangan insulin NPs30 ning sitotoksikligini baholash uchun ishlatilgan. HepG2 hujayralari 96 quduqli plastinkalarga 5 × 104 hujayra/ml zichlikda ekilgan va sinovdan oldin 7 kun davomida kultivatsiya qilingan. Insulin NPlari kultivatsiya muhitida turli konsentratsiyalarga (50 dan 500 mkg/ml gacha) suyultirilgan va keyin hujayralarga yuborilgan. 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng, hujayralar PBS bilan 3 marta yuvilgan va qo'shimcha 4 soat davomida 0,5 mg/ml MTT saqlovchi muhit bilan inkubatsiya qilingan. Sitotoksiklik Tecan infinite M200 pro spektrofotometr plastinka o'quvchi (Tecan, Männedorf, Shveytsariya) yordamida sariq tetrazolium MTT ning 570 nm da binafsha formazangacha fermentativ kamayishini o'lchash orqali baholandi.
NPlarning hujayra tomonidan qabul qilish samaradorligi konfokal lazer skanerlash mikroskopiyasi va oqim sitometriyasi tahlili yordamida sinovdan o'tkazildi. Nunc Lab-Tek kamerali slayd tizimining har bir qudug'i erkin FITC-insulin, FITC-insulin bilan to'ldirilgan NPlar bilan ishlov berildi va 25 mkg/ml suvsizlangan FITC-insulin NPlari bir xil konsentratsiyada qayta tiklandi va 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Hujayralar PBS bilan 3 marta yuvildi va 4% paraformaldegid bilan fiksatsiya qilindi. Yadrolar 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) bilan bo'yaldi. Insulin lokalizatsiyasi Olympus FV1000 lazer skanerlash/ikki fotonli konfokal mikroskop (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Yaponiya) yordamida kuzatildi. Oqim sitometriyasi tahlili uchun 10 mkg/ml erkin FITC-insulin, FITC-insulin bilan to'ldirilgan NPlar va qayta erigan suvsizlangan NPlarning bir xil konsentratsiyalari. FITC-insulin NPlari HepG2 hujayralari ekilgan 96 quduqli plastinkalarga qo'shildi va 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. 4 soatlik inkubatsiyadan so'ng hujayralar olib tashlandi va FBS bilan 3 marta yuvildi. Har bir namunada 5 × 104 hujayra BD LSR II oqim sitometri (BD, Franklin Lakes, Nyu-Jersi, Qo'shma Shtatlar) yordamida tahlil qilindi.
Barcha qiymatlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida ifodalanadi. Barcha guruhlar o'rtasidagi taqqoslashlar IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Nyu-York, AQSh) tomonidan bir tomonlama ANOVA yoki t-test yordamida baholandi va p < 0,05 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblandi.
Ushbu tadqiqot purkash orqali quritishning moslashuvchanligi va o'zaro bog'langan xitosan/TPP/insulin nanopartikullarini suvsizlantirish qobiliyatini namoyish etadi, bu esa standart muzlatish-quritish usullariga nisbatan yaxshiroq qayta tiklash imkonini beradi va bulg'ovchi vositalar yoki krioprotektorlar sig'imi va yuqori yuk ko'tarish qobiliyatini ta'minlaydi. Optimallashtirilgan insulin nanopartikullari o'rtacha zarracha hajmi 318 nm va kapsulalash samaradorligi 99,4% ni tashkil etdi. Suvsizlantirishdan keyingi SEM va FTIR natijalari shuni ko'rsatdiki, sharsimon tuzilish faqat mannitol bilan va mannitolsiz va mannitol bilan liofilizatsiya qilingan purkash orqali quritilgan NPlarda saqlanib qolgan, ammo mannitolsiz liofilizatsiya qilingan NPlar suvsizlantirish paytida parchalangan. Qayta tiklash qobiliyati sinovida mannitolsiz purkash orqali quritilgan insulin nanopartikullari eng kichik o'rtacha zarracha hajmini va qayta tiklashda eng yuqori yuklanishni ko'rsatdi. Ushbu barcha suvsizlangan NPlarning ajralib chiqish xususiyatlari shuni ko'rsatdiki, ular pH = 2,5 va pH = 7 eritmalarda tez ajralib chiqadi va pH = 6,5 eritmada juda barqaror. Boshqa qayta eriganlarga nisbatan Suvsizlangan NPlarda, mannitolsiz purkash bilan quritilgan NPlar eng tez ajralib chiqishni ko'rsatdi. Bu natija hujayralarni qabul qilish tahlilida kuzatilgan natijaga mos keladi, chunki mannitolsiz purkash bilan quritilgan NPlar yangi tayyorlangan NPlarning hujayralarni qabul qilish samaradorligini deyarli to'liq saqlab qoldi. Bu natijalar mannitolsiz purkash bilan quritish orqali tayyorlangan quruq insulin nanopartikullari og'iz orqali qabul qilinadigan tabletkalar yoki bioyopishqoq plyonkalar kabi boshqa suvsiz dozalash shakllariga keyingi ishlov berish uchun eng mos kelishini ko'rsatadi.
Intellektual mulk bilan bog'liq muammolar tufayli, joriy tadqiqot davomida yaratilgan va/yoki tahlil qilingan ma'lumotlar to'plamlari ommaga ochiq emas, lekin tegishli mualliflardan oqilona so'rov bo'yicha foydalanish mumkin.
Kagan, A. 2-toifa diabet: ijtimoiy va ilmiy kelib chiqishi, tibbiy asoratlari va bemorlar va boshqalar uchun oqibatlari. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Insulin kapsulasini ishlab chiqish: endi og'iz orqali qabul qilish mumkinmi? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Qandli diabetni davolash uchun og'iz orqali insulin bilan to'ldirilgan liposomalarni yetkazib berish tizimlaridagi so'nggi yutuqlar. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).