Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi natijalarga erishish uchun brauzeringizning yangi versiyasidan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz yoki JavaScriptsiz ko'rsatmoqdamiz.
Propion kislotasi (PPA) autizm spektrining buzilishi kabi neyrorivojlanish buzilishlarida mitoxondrial disfunktsiyaning rolini o'rganish uchun ishlatiladi. PPA mitoxondrial biogenez, metabolizm va almashinuvni buzishi ma'lum. Biroq, PPA ning mitoxondrial dinamikaga, bo'linishga va sintezga ta'siri ushbu mexanizmlarning murakkab vaqtinchalik tabiati tufayli muammoli bo'lib qolmoqda. Bu yerda biz PPA neyronga o'xshash SH-SY5Y hujayralarida mitoxondrial ultrastruktura, morfologiya va dinamikaga qanday ta'sir qilishini o'rganish uchun qo'shimcha miqdoriy tasvirlash usullaridan foydalanamiz. PPA (5 mM) mitoxondrial maydonning (p < 0,01), Feret diametri va atrofi (p < 0,05) va 2-maydonning (p < 0,01) sezilarli darajada pasayishiga olib keldi. Mitoxondrial hodisa lokatorini tahlil qilish bo'linish va sintez hodisalarida sezilarli darajada oshganligini (p < 0,05) ko'rsatdi va shu bilan stress sharoitida mitoxondrial tarmoqning yaxlitligini saqlab qoldi. Bundan tashqari, cMYC (p <0.0001), NRF1 (p <0.01), TFAM (p <0.05), STOML2 (p <0.0001) va OPA1 (p <0.05) ning mRNA ekspressiyasi sezilarli darajada kamaydi. 01). Bu stress sharoitida funktsiyani saqlab qolish uchun mitoxondrial morfologiya, biogenez va dinamikaning qayta modellashtirilishini ko'rsatadi. Bizning ma'lumotlarimiz PPA ning mitoxondrial dinamikaga ta'siri haqida yangi tushuncha beradi va mitoxondrial stress reaksiyalarida ishtirok etadigan murakkab tartibga solish mexanizmlarini o'rganish uchun tasvirlash texnikasining foydaliligini ta'kidlaydi.
Mitoxondriyal metabolizm energiya ishlab chiqarish va biosintezdagi odatiy rollaridan tashqari turli xil hujayra funktsiyalarining ajralmas ishtirokchilaridir. Mitoxondriyal metabolizm kaltsiy signalizatsiyasi, metabolik va oksidlanish-qaytarilish gomeostazining, yallig'lanish signalizatsiyasining, epigenetik modifikatsiyalarning, hujayra proliferatsiyasining, differentsiatsiyaning va dasturlashtirilgan hujayra o'limining asosiy regulyatoridir1. Xususan, mitoxondriyal metabolizm neyronlarning rivojlanishi, omon qolishi va faoliyati uchun juda muhimdir va neyropatologiyaning turli ko'rinishlarida keng qo'llaniladi2,3,4.
So'nggi o'n yillikda metabolik holat neyrogenez, differentsiatsiya, yetilish va plastiklikning markaziy regulyatori sifatida paydo bo'ldi5,6. Yaqinda mitoxondrial morfologiya va dinamika mitozning, hujayralar ichida sog'lom mitoxondriallar havzasini saqlaydigan dinamik jarayonning ayniqsa muhim tarkibiy qismlariga aylandi. Mitoxondrial dinamika mitoxondrial biogenez va bioenergetikadan mitoxondrial bo'linish, sintez, transport va tozalashgacha bo'lgan murakkab o'zaro bog'liq yo'llar bilan tartibga solinadi7,8. Ushbu integrativ mexanizmlarning har qandayining buzilishi sog'lom mitoxondrial tarmoqlarni saqlashga putur yetkazadi va neyrorivojlanish uchun chuqur funktsional oqibatlarga olib keladi9,10. Darhaqiqat, mitoxondrial dinamikaning buzilishi ko'plab psixiatrik, neyrodegenerativ va neyrorivojlanish buzilishlarida, jumladan, autizm spektri buzilishlarida (ASD) kuzatiladi11,12.
ASD murakkab genetik va epigenetik arxitekturaga ega bo'lgan heterojen neyrorivojlanish buzilishidir. ASD ning irsiyligi shubhasiz, ammo asosiy molekulyar etiologiyasi hali ham yaxshi tushunilmagan. Klinikgacha bo'lgan modellar, klinik tadqiqotlar va multi-omics molekulyar ma'lumotlar to'plamlaridan to'plangan ma'lumotlar ASD13,14 da mitoxondrial disfunktsiyaning tobora ko'proq dalillarini taqdim etadi. Biz ilgari ASD bilan og'rigan bemorlar kohortasida genom bo'ylab DNK metilatsiyasi skriningini o'tkazdik va mitoxondrial metabolik yo'llar bo'ylab klasterlangan differentsial metillangan genlarni aniqladik15. Keyinchalik biz mitoxondrial biogenez va dinamikaning markaziy regulyatorlarining differentsial metilatsiyasi haqida xabar berdik, bu ASD16 da mtDNK nusxasi sonining ko'payishi va siydik metabolik profilining o'zgarishi bilan bog'liq edi. Bizning ma'lumotlarimiz mitoxondrial dinamika va gomeostaz ASD patofiziologiyasida markaziy rol o'ynashiga oid tobora ko'proq dalillarni taqdim etadi. Shuning uchun, mitoxondrial dinamika, morfologiya va funktsiya o'rtasidagi bog'liqlikni mexanik tushunishni yaxshilash ikkilamchi mitoxondrial disfunktsiya bilan tavsiflangan nevrologik kasalliklar bo'yicha davom etayotgan tadqiqotlarning asosiy maqsadi hisoblanadi.
Molekulyar texnikalar ko'pincha mitoxondrial stress reaksiyalarida ma'lum genlarning rolini o'rganish uchun qo'llaniladi. Biroq, bu yondashuv mitotik nazorat mexanizmlarining ko'p qirrali va vaqtinchalik tabiati bilan cheklangan bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, mitoxondrial genlarning differentsial ifodalanishi funktsional o'zgarishlarning bilvosita ko'rsatkichidir, ayniqsa odatda faqat cheklangan miqdordagi genlar tahlil qilinganligi sababli. Shuning uchun mitoxondrial funktsiya va bioenergetikani o'rganish uchun ko'proq to'g'ridan-to'g'ri usullar taklif qilingan17. Mitoxondrial morfologiya mitoxondrial dinamika bilan chambarchas bog'liq. Mitoxondrial shakli, bog'liqligi va tuzilishi energiya ishlab chiqarish, mitoxondrial va hujayralarning omon qolishi uchun juda muhimdir5,18. Bundan tashqari, mitozning turli komponentlari mitoxondrial morfologiyadagi o'zgarishlarga qaratilgan bo'lib, ular mitoxondrial disfunktsiyaning foydali yakuniy nuqtalari bo'lib xizmat qilishi va keyingi mexanik tadqiqotlar uchun asos bo'lib xizmat qilishi mumkin.
Mitoxondrial morfologiyani to'g'ridan-to'g'ri transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) yordamida kuzatish mumkin, bu hujayra ultrastrukturasini batafsil o'rganish imkonini beradi. TEM hujayra populyatsiyalarida faqat gen transkripsiyasi, oqsil ekspressiyasi yoki mitoxondrial funktsional parametrlarga tayanish o'rniga, individual mitoxondrial kristallarning morfologiyasi, shakli va tuzilishini bevosita vizualizatsiya qiladi17,19,20. Bundan tashqari, TEM mitoxondrial funktsiya va gomeostazda muhim rol o'ynaydigan endoplazmatik retikulum va avtofagosomalar kabi mitoxondrial va boshqa organellalar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni o'rganishni osonlashtiradi21,22. Shunday qilib, bu TEMni ma'lum yo'llar yoki genlarga e'tibor qaratishdan oldin mitoxondrial disfunktsiyani o'rganish uchun yaxshi boshlang'ich nuqtaga aylantiradi. Mitoxondrial funktsiya neyropatologiya uchun tobora dolzarb bo'lib borayotganligi sababli, in vitro neyronal modellarda mitoxondrial morfologiya va dinamikani to'g'ridan-to'g'ri va miqdoriy jihatdan o'rganish imkoniyatiga ega bo'lish zarurati paydo bo'ladi.
Ushbu maqolada biz autizm spektri buzilishida mitoxondrial disfunktsiyaning neyronal modelida mitoxondrial dinamikani o'rganamiz. Biz ilgari mitoxondrial propionil-CoA karboksilaza fermenti PCC ning subbirligi bo'lgan ASD15 da propionil-CoA karboksilaza beta (PCCB) ning differentsial metillanishi haqida xabar bergan edik. PCC ning disregulyatsiyasi propionil hosilalarining, jumladan, propion kislotasining (PPA) toksik to'planishiga olib kelishi ma'lum23,24,25. PPA neyron metabolizmini buzishi va in vivo xulq-atvorni o'zgartirishi ko'rsatilgan va ASD26,27,28 da ishtirok etadigan neyrorivojlanish mexanizmlarini o'rganish uchun o'rnatilgan hayvon modelidir. Bundan tashqari, PPA in vitro mitoxondrial membrana potentsiali, biogenez va nafas olishni buzishi haqida xabar berilgan va neyronlarda mitoxondrial disfunktsiyani modellashtirish uchun keng qo'llanilgan29,30. Biroq, PPA tomonidan qo'zg'atilgan mitoxondrial disfunktsiyaning mitoxondrial morfologiya va dinamikaga ta'siri hali ham yaxshi tushunilmagan.
Ushbu tadqiqotda SH-SY5Y hujayralarida PPA ning mitoxondrial morfologiya, dinamika va funksiyaga ta'sirini aniqlash uchun qo'shimcha tasvirlash texnikasidan foydalaniladi. Birinchidan, biz mitoxondrial morfologiya va ultrastrukturadagi o'zgarishlarni vizualizatsiya qilish uchun TEM usulini ishlab chiqdik17,31,32. Mitoxondriallarning33 dinamik tabiatini hisobga olgan holda, biz shuningdek, PPA stressi ostida bo'linish va sintez hodisalari, mitoxondrial soni va hajmi o'rtasidagi muvozanatdagi o'zgarishlarni aniqlash uchun mitoxondrial hodisa lokalizatori (MEL) tahlilidan foydalandik. Nihoyat, biz mitoxondrial morfologiya va dinamika biogenez, parchalanish va sintezda ishtirok etadigan genlarning ifodalanishidagi o'zgarishlar bilan bog'liqligini tekshirdik. Birgalikda, bizning ma'lumotlarimiz mitoxondrial dinamikani tartibga soluvchi mexanizmlarning murakkabligini aniqlashdagi qiyinchilikni ko'rsatadi. Biz SH-SY5Y hujayralarida mitozning o'lchanadigan konvergent so'nggi nuqtasi sifatida mitoxondrial morfologiyani o'rganishda TEMning foydaliligini ta'kidlaymiz. Bundan tashqari, biz TEM ma'lumotlari metabolik stressga javoban dinamik hodisalarni ham ushlaydigan tasvirlash texnikalari bilan birlashtirilganda eng boy ma'lumotlarni taqdim etishini ta'kidlaymiz. Neyron hujayralari mitozini qo'llab-quvvatlovchi molekulyar tartibga solish mexanizmlarining keyingi tavsifi asab tizimining mitoxondrial komponenti va neyrodegenerativ kasalliklar haqida muhim tushuncha berishi mumkin.
Mitoxondrial stressni keltirib chiqarish uchun SH-SY5Y hujayralari 3 mM va 5 mM natriy propionat (NaP) yordamida PPA bilan ishlov berildi. TEMdan oldin namunalar yuqori bosimli muzlatish va muzlatish yordamida kriogen namunalar tayyorlashga duchor qilindi (1a-rasm). Biz uchta biologik replikatsiya bo'yicha mitoxondrial populyatsiyalarning sakkizta morfologik parametrlarini o'lchash uchun avtomatlashtirilgan mitoxondrial tasvir tahlil quvurini ishlab chiqdik. Biz PPA bilan ishlov berish to'rtta parametrni sezilarli darajada o'zgartirganini aniqladik: 2-maydon, maydon, perimetr va Feret diametri (1b-e-rasm). 2-maydon 3 mM va 5 mM PPA bilan ishlov berishda sezilarli darajada kamaydi (p = 0,0183 va p = 0,002 mos ravishda) (1b-rasm), maydon (p = 0,003), perimetr (p = 0,0106) va Feret diametri sezilarli darajada kamaydi. Nazorat guruhiga nisbatan 5 mM bilan ishlov berish guruhida sezilarli darajada pasayish (p = 0,0172) kuzatildi (1c-e-rasm). Maydoni va atrofi sezilarli darajada kamayishi 5 mM PPA bilan ishlov berilgan hujayralarda kichikroq, yumaloqroq mitoxondriyalar borligini va bu mitoxondriyalar nazorat hujayralaridagiga qaraganda kamroq cho'zilganligini ko'rsatdi. Bu, shuningdek, zarracha qirralari orasidagi eng katta masofaning pasayishini ko'rsatuvchi mustaqil parametr bo'lgan Feret diametrining sezilarli darajada pasayishi bilan ham mos keladi. Kristalarning ultrastrukturasidagi o'zgarishlar kuzatildi: PPA stressi ta'sirida kristalar kamroq sezilib qoldi (1a-rasm, B paneli). Biroq, barcha tasvirlar kristalarning ultrastrukturasini aniq aks ettirmadi, shuning uchun bu o'zgarishlarning miqdoriy tahlili o'tkazilmadi. Ushbu TEM ma'lumotlari uchta mumkin bo'lgan stsenariyni aks ettirishi mumkin: (1) PPA bo'linishni kuchaytiradi yoki birlashishni inhibe qiladi, bu esa mavjud mitoxondriyalarning hajmini kichraytirishiga olib keladi; (2) biogenezning kuchayishi yangi, kichikroq mitoxondriyalarni yaratadi yoki (3) ikkala mexanizmni bir vaqtning o'zida qo'zg'atadi. Garchi bu sharoitlarni TEM bilan ajratib bo'lmasa-da, sezilarli morfologik o'zgarishlar mitoxondrial gomeostaz va PPA stressi ostida dinamikadagi o'zgarishlarni ko'rsatadi. Keyinchalik biz ushbu dinamikani va ularning asosidagi potentsial mexanizmlarni yanada tavsiflash uchun qo'shimcha parametrlarni o'rganib chiqdik.
Propion kislotasi (PPA) mitoxondrial morfologiyani qayta shakllantiradi. (a) PPA bilan davolashning ortishi bilan mitoxondrial o'lchamlarning kamayib, mitoxondriallarning kichrayib, yumaloqlashib borishini ko'rsatuvchi vakillik transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) tasvirlari; mos ravishda 0 mM (davolanmagan), 3 mM va 5 mM. Qizil strelkalar mitoxondriallarni bildiradi. (b–e) 24 soat davomida PPA bilan davolangan SH-SY5Y hujayralari TEM uchun tayyorlandi va natijalar Fiji/ImageJ yordamida tahlil qilindi. Sakkiz parametrdan to'rttasi nazorat (davolanmagan, 0 mM PPA) va davolangan (3 mM va 5 mM PPA) hujayralar o'rtasida sezilarli farqlarni ko'rsatdi. (b) 2-mintaqa, (c) Maydon, (d) Perimetr, (e) Feret diametri. Muhim farqlarni aniqlash uchun bir tomonlama dispersiya tahlili (nazorat va davolash) va Dunnettning ko'p taqqoslash testi qo'llanildi (p < 0,05). Ma'lumotlar nuqtalari har bir alohida hujayra uchun o'rtacha mitoxondrial qiymatni, xato chiziqlari esa o'rtacha ± SEMni ifodalaydi. Ko'rsatilgan ma'lumotlar n = 3 ni ifodalaydi, har bir replikatsiya uchun kamida 24 ta katakcha; jami 266 ta rasm tahlil qilindi; * p < 0,05 ni, ** p < 0,01 ni bildiradi.
Mitoxondrial dinamikaning PPA ga qanday javob berishini yanada aniqroq tavsiflash uchun biz mitoxondriallarni tetrametilrodamin etil efiri (TMRE) bilan bo'yadik va 3 va 5 mM PPA da 24 soatdan keyin mitoxondriallarni lokalizatsiya qilish va miqdorini aniqlash uchun vaqt oralig'idagi mikroskopiya va MEL tahlilidan foydalandik. Bo'linish va sintez hodisalarini davolash. (2a-rasm). MEL tahlilidan so'ng, mitoxondrial tuzilmalar sonini va ularning o'rtacha hajmini aniqlash uchun mitoxondriallar qo'shimcha tahlil qilindi. Biz 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] da sodir bo'ladigan bo'linish hodisalari sonining kichik, ammo sezilarli darajada oshishini kuzatdik, bu bo'linish [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] va sintez [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] va sintez [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] hodisalariga nisbatan 5 mM da sezilarli darajada oshdi (3b-rasm). Mitoxondriyalar soni ikkala 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] va 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] da sezilarli darajada oshdi (3c-rasm), har bir mitoxondrial strukturaning o'rtacha hajmi esa o'zgarishsiz qoldi (3c-rasm). 3d). Birgalikda, bu mitoxondrial dinamikani qayta qurish mitoxondrial tarmoqning yaxlitligini muvaffaqiyatli saqlab turadigan kompensator javob bo'lib xizmat qilishini ko'rsatadi. 3 mM PPA da bo'linish hodisalari sonining ko'payishi mitoxondrial sonning ko'payishi qisman mitoxondrial bo'linish bilan bog'liqligini ko'rsatadi, ammo o'rtacha mitoxondrial hajm asosan o'zgarishsiz qolishini hisobga olsak, biogenezni qo'shimcha kompensator javob sifatida inkor etib bo'lmaydi. Biroq, bu ma'lumotlar TEM tomonidan kuzatilgan kichikroq, yumaloq mitoxondrial tuzilmalar bilan mos keladi va shuningdek, PPA tomonidan qo'zg'atilgan mitoxondrial dinamikada sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatadi.
Propion kislotasi (PPA) tarmoq yaxlitligini saqlab qolish uchun dinamik mitoxondrial qayta tuzilishni keltirib chiqaradi. SH-SY5Y hujayralari kultivatsiya qilindi, 24 soat davomida 3 va 5 mM PPA bilan ishlov berildi va TMRE va Hoechst 33342 bilan bo'yaldi, so'ngra MEL tahlili o'tkazildi. (a) Har bir holat uchun 2-vaqtda (t2) rangli va binarizatsiya qilingan maksimal intensivlik proektsiyalarini aks ettiruvchi vakillik vaqt oralig'idagi mikroskopiya tasvirlari. Har bir ikkilik tasvirda ko'rsatilgan tanlangan mintaqalar vaqt o'tishi bilan dinamikani ko'rsatish uchun uch xil vaqt oralig'ida (t1-t3) 3D formatda yaxshilandi va namoyish etildi; birlashish hodisalari yashil rangda belgilangan; bo'linish hodisalari yashil rangda belgilangan. Qizil rangda ko'rsatilgan. (b) Har bir holat uchun dinamik hodisalarning o'rtacha soni. (c) Har bir hujayra uchun mitoxondrial tuzilmalarning o'rtacha soni. (d) Har bir hujayra uchun har bir mitoxondrial tuzilmaning o'rtacha hajmi (µm3). Ko'rsatilgan ma'lumotlar har bir davolash guruhi uchun n = 15 hujayrani ifodalaydi. Ko'rsatilgan xato satrlari o'rtacha ± SEMni ifodalaydi, masshtab satri = 10 μm, * p < 0.05.
Propion kislotasi (PPA) mitoxondrial dinamika bilan bog'liq genlarning transkripsiyaviy bostirilishiga olib keladi. SH-SY5Y hujayralari 24 soat davomida 3 va 5 mM PPA bilan ishlov berildi. Nisbiy gen miqdori RT-qPCR yordamida amalga oshirildi va B2M ga normallashtirildi. Mitoxondrial biogenez genlari (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 va (d) NFE2L2. Mitoxondrial sintez va bo'linish genlari (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 va (i) DRP1. Muhim farqlar (p < 0,05) bir tomonlama ANOVA (nazorat va davolash) va Dunnettning ko'p taqqoslash testi yordamida sinovdan o'tkazildi: * p < 0,05 ni, ** p < 0,01 ni va **** p < 0,0001 ni bildiradi. Barlar o'rtacha ifoda ± SEM ni ifodalaydi. Ko'rsatilgan ma'lumotlar n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) va n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologik replikatsiyalarni ifodalaydi.
TEM va MEL tahlillaridan olingan ma'lumotlar birgalikda PPA mitoxondrial morfologiya va dinamikani o'zgartirishini ko'rsatadi. Biroq, bu tasvirlash usullari ushbu jarayonlarni boshqaradigan asosiy mexanizmlar haqida tushuncha bermaydi. Shuning uchun biz PPA bilan davolashga javoban mitoxondrial dinamika, biogenez va mitozning to'qqizta asosiy regulyatorining mRNK ifodasini o'rganib chiqdik. Biz hujayra miyelomasi onkogenini (cMYC), yadroviy nafas olish omili (NRF1), mitoxondrial transkripsiya omili 1 (TFAM), NFE2 ga o'xshash transkripsiya omili BZIP (NFE2L2), gastringa o'xshash oqsil 2 (STOML2), optik asab atrofiyasi 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) va dinamin bilan bog'liq oqsil 1 (DRP1) ni 24 soatlik 3 mM va 5 mM PPA bilan davolashdan so'ng aniqladik. Biz 3 mM (mos ravishda p = 0.0053, p = 0.0415 va p < 0.0001) va 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA bilan davolashni kuzatdik. (3a-c-rasm). mRNK ekspressiyasining pasayishi dozaga bog'liq edi: cMYC, NRF1 va TFAM ekspressiyasi 3 mM da mos ravishda 5.7, 2.6 va 1.9 martaga, 5 mM da esa 11.2, 3 va 2.2 martaga kamaydi. Aksincha, markaziy redoks biogenez geni NFE2L2 PPA ning biron bir konsentratsiyasida o'zgarmadi, ammo ekspressiyaning pasayishining shunga o'xshash dozaga bog'liq tendentsiyasi kuzatildi (3d-rasm).
Shuningdek, biz bo'linish va sintezni boshqarishda ishtirok etadigan klassik genlarning ifodasini ham o'rganib chiqdik. STOML2 sintez, mitofagiya va biogenezda ishtirok etadi deb hisoblanadi va uning ifodasi 3 mM (2,4 marta o'zgarish) va 5 mM (2,8 marta o'zgarish) PPA ga sezilarli darajada kamaydi (p < 0,0001) (1-rasm). 3d-rasm). Xuddi shunday, OPA1 sintez genining ifodasi 3 mM (1,6 marta o'zgarish) va 5 mM (1,9 marta o'zgarish) PPA da kamaydi (mos ravishda p = 0,006 va p = 0,0024) (3f-rasm). Biroq, biz 24 soatlik PPA stressi ostida MFN1, MFN2 sintez genlari yoki DRP1 sintez genining ifodasida sezilarli farqlarni topmadik (3g–i-rasm). Bundan tashqari, biz to'rtta sintez va bo'linish oqsillari (OPA1, MFN1, MFN2 va DRP1) darajalari bir xil sharoitlarda o'zgarmaganligini aniqladik (4a–d-rasm). Shuni ta'kidlash kerakki, bu ma'lumotlar vaqt ichida bitta nuqtani aks ettiradi va PPA stressining dastlabki bosqichlarida oqsil ifodasi yoki faollik darajasidagi o'zgarishlarni aks ettirmasligi mumkin. Biroq, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 va OPA1 ifodasining sezilarli darajada pasayishi mitoxondrial metabolizm, biogenez va dinamikaning sezilarli transkripsiyaviy disregulyatsiyasini ko'rsatadi. Bundan tashqari, bu ma'lumotlar mitoxondrial funktsiyadagi oxirgi holat o'zgarishlarini bevosita o'rganish uchun tasvirlash texnikasining foydaliligini ta'kidlaydi.
Propion kislotasi (PPA) bilan ishlov berilgandan so'ng, sintez va bo'linish faktori oqsil darajasi o'zgarmadi. SH-SY5Y hujayralari 24 soat davomida 3 va 5 mM PPA bilan ishlov berildi. Oqsil darajasi Western blot tahlili yordamida aniqlandi va ifoda darajasi umumiy oqsilga normallashtirildi. O'rtacha oqsil ifodasi va maqsadli va umumiy oqsilning vakillik Western blotlari ko'rsatilgan. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Barlar o'rtacha ± SEM ni ifodalaydi va ko'rsatilgan ma'lumotlar n = 3 biologik replikatsiyani ifodalaydi. Bir tomonlama dispersiya tahlili va Dunnett testi yordamida ko'p taqqoslashlar (p < 0,05) amalga oshirildi. Asl gel va blot S1-rasmda ko'rsatilgan.
Mitoxondriyal disfunktsiya metabolik, yurak-qon tomir va mushak kasalliklaridan tortib nevrologik kasalliklargacha bo'lgan ko'p tizimli kasalliklar bilan bog'liq1,10. Ko'pgina neyrodegenerativ va neyrodegenerativ kasalliklar mitoxondriyal disfunktsiya bilan bog'liq bo'lib, bu miyaning butun umri davomida ushbu organellalarning ahamiyatini ta'kidlaydi. Bu kasalliklarga Parkinson kasalligi, Altsgeymer kasalligi va ASD kiradi3,4,18. Biroq, bu kasalliklarni o'rganish uchun miya to'qimalariga kirish qiyin, ayniqsa mexanik darajada, bu hujayra model tizimlarini zarur alternativaga aylantiradi. Ushbu tadqiqotda biz neyronal kasalliklarda, xususan, autizm spektri buzilishlarida kuzatiladigan mitoxondriyal disfunktsiyani takroriy takrorlash uchun PPA bilan ishlov berilgan SH-SY5Y hujayralaridan foydalanadigan hujayra model tizimidan foydalanamiz. Neyronlardagi mitoxondriyal dinamikani o'rganish uchun ushbu PPA modelidan foydalanish ASD etiologiyasi haqida tushuncha berishi mumkin.
Biz mitoxondrial morfologiyadagi o'zgarishlarni ko'rish uchun TEM dan foydalanish imkoniyatini o'rganib chiqdik. Shuni ta'kidlash kerakki, TEM samaradorligini oshirish uchun uni to'g'ri ishlatish kerak. Krio-namunalarni tayyorlash bir vaqtning o'zida hujayra komponentlarini fiksatsiya qilish va artefaktlarning shakllanishini kamaytirish orqali neyron tuzilmalarini yaxshiroq saqlash imkonini beradi34. Shunga muvofiq, biz neyronga o'xshash SH-SY5Y hujayralarida butun hujayra osti organellalar va cho'zilgan mitoxondriyalar mavjudligini kuzatdik (1a-rasm). Bu neyron hujayra modellarida mitoxondrial morfologiyani o'rganish uchun kriogen tayyorlash texnikasining foydaliligini ta'kidlaydi. TEM ma'lumotlarini obyektiv tahlil qilish uchun miqdoriy o'lchovlar juda muhim bo'lsa-da, mitoxondrial morfologik o'zgarishlarni tasdiqlash uchun qanday aniq parametrlarni o'lchash kerakligi borasida hali ham kelishuv mavjud emas. Mitoxondrial morfologiyani miqdoriy jihatdan o'rgangan ko'plab tadqiqotlarga asoslanib17,31,32, biz sakkizta morfologik parametrlarni, ya'ni: maydon, maydon2, aspekt nisbati, perimetr, aylanalik, daraja, Feret diametri va yumaloqlikni o'lchaydigan avtomatlashtirilgan mitoxondrial tasvir tahlil quvur liniyasini ishlab chiqdik.
Ular orasida PPA 2-maydonni, maydonni, perimetrni va Feret diametrini sezilarli darajada kamaytirdi (1b–e-rasm). Bu mitoxondriyalarning kichrayib, yumaloqlashib ketganini ko'rsatdi, bu PPA30 tomonidan qo'zg'atilgan mitoxondrial stressning 72 soatidan keyin mitoxondrial maydonning kamayishini ko'rsatgan oldingi tadqiqotlar bilan mos keladi. Bu morfologik xususiyatlar mitoxondrial bo'linishni ko'rsatishi mumkin, bu mitoxondrial tarmoqdan shikastlangan komponentlarni ajratib olish va ularning mitofagiya orqali parchalanishini rag'batlantirish uchun zarur bo'lgan jarayondir35,36,37. Boshqa tomondan, o'rtacha mitoxondrial o'lchamning pasayishi biogenezning oshishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu esa kichik yangi paydo bo'lgan mitoxondriyalarning shakllanishiga olib keladi. Bo'linish yoki biogenezning oshishi mitoxondrial stressga qarshi mitozni saqlab qolish uchun kompensator javobni ifodalaydi. Biroq, mitoxondrial o'sishning pasayishi, sintezning buzilishi yoki boshqa holatlarni istisno qilib bo'lmaydi.
TEM tomonidan yaratilgan yuqori aniqlikdagi tasvirlar individual mitoxondriyalar darajasida morfologik xususiyatlarni aniqlashga imkon bersa-da, bu usul vaqtning bir nuqtasida ikki o'lchovli suratlarni hosil qiladi. Metabolik stressga dinamik javoblarni o'rganish uchun biz mitoxondriyalarni TMRE bilan bo'yadik va MEL tahlili bilan vaqt oralig'idagi mikroskopiyadan foydalandik, bu esa vaqt o'tishi bilan mitoxondrial tarmoqdagi o'zgarishlarni yuqori o'tkazuvchanlikdagi 3D vizualizatsiya qilish imkonini beradi33,38. Biz PPA stressi ostida mitoxondrial dinamikada nozik, ammo sezilarli o'zgarishlarni kuzatdik (2-rasm). 3 mM da bo'linish hodisalari soni sezilarli darajada oshdi, birikish hodisalari esa nazoratdagidek qoldi. 5 mM PPA da ham bo'linish, ham birikish hodisalari sonining ortishi kuzatildi, ammo bu o'zgarishlar taxminan mutanosib bo'lib, bu bo'linish va birikish kinetikasi yuqori konsentratsiyalarda muvozanatga erishishini ko'rsatadi (2b-rasm). O'rtacha mitoxondrial hajm 3 va 5 mM PPA da o'zgarishsiz qoldi, bu mitoxondrial tarmoqning yaxlitligi saqlanib qolganligini ko'rsatadi (2d-rasm). Bu dinamik mitoxondrial tarmoqlarning tarmoq parchalanishiga olib kelmasdan gomeostazni samarali saqlash uchun yengil metabolik stressga javob berish qobiliyatini aks ettiradi. 3 mM PPA da bo'linishning oshishi yangi muvozanatga o'tishni rag'batlantirish uchun etarli, ammo PPA ning yuqori konsentratsiyasi keltirib chiqaradigan stressga javoban chuqurroq kinetik qayta qurish talab etiladi.
Mitoxondriyalar soni ikkala PPA stress konsentratsiyasida ham oshdi, ammo o'rtacha mitoxondriyal hajm sezilarli darajada o'zgarmadi (2c-rasm). Bu biogenezning oshishi yoki bo'linishning ko'payishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin; ammo, o'rtacha mitoxondriyal hajmning sezilarli darajada pasayishi bo'lmaganda, biosintezning oshishi ehtimoli ko'proq. Biroq, 2-rasmdagi ma'lumotlar ikkita kompensator mexanizmining mavjudligini qo'llab-quvvatlaydi: mitoxondriyal bo'linishning yuqori regulyatsiyasi bilan mos keladigan bo'linish hodisalari sonining ko'payishi va mitoxondrial biogenez bilan mos keladigan hodisalar sonining ko'payishi. Oxir-oqibat, yengil stress uchun dinamik kompensatsiya bo'linish, sintez, biogenez va mitofagiyani o'z ichiga olgan bir vaqtning o'zida sodir bo'ladigan jarayonlardan iborat bo'lishi mumkin. Avvalgi mualliflar PPA mitozni30,39 va mitofagiyani29 kuchaytirishini ko'rsatgan bo'lsalar-da, biz PPAga javoban mitoxondrial bo'linish va sintez dinamikasini qayta modellashtirish uchun dalillarni taqdim etamiz. Ushbu ma'lumotlar TEM tomonidan kuzatilgan morfologik o'zgarishlarni tasdiqlaydi va PPA tomonidan qo'zg'atilgan mitoxondriyal disfunktsiya bilan bog'liq mexanizmlar haqida qo'shimcha ma'lumot beradi.
TEM ham, MEL ham tahlili kuzatilgan morfologik o'zgarishlar asosidagi genlarni tartibga solish mexanizmlarining to'g'ridan-to'g'ri dalillarini taqdim etmagani uchun, biz mitoxondrial metabolizm, biogenez va dinamikada ishtirok etadigan genlarning RNK ekspressiyasini tekshirdik. cMYC proto-onkogeni mitoxondrial transkripsiya, glikoliz, aminokislotalar va yog 'kislotalari metabolizmini tartibga solishda ishtirok etadigan transkripsiya omilidir40. Bundan tashqari, cMYC NRF1 va TFAM41 ni o'z ichiga olgan mitoxondrial transkripsiya, tarjima va kompleks yig'ishda ishtirok etadigan deyarli 600 mitoxondrial genlarning ekspressiyasini tartibga solishi ma'lum. NRF1 va TFAM mitozning ikkita markaziy regulyatori bo'lib, PGC-1α dan keyin mtDNK replikatsiyasini faollashtirish uchun harakat qiladi. Bu yo'l cAMP va AMPK signalizatsiyasi orqali faollashadi va energiya sarfi va metabolik stressga sezgir. Shuningdek, biz PPA ta'siri oksidlovchi stress orqali vositachilik qilinishi mumkinligini aniqlash uchun mitoxondrial biogenezning oksidlanish-qaytarilish regulyatori NFE2L2 ni tekshirdik.
NFE2L2 ifodasi o'zgarishsiz qolgan bo'lsa-da, biz 3 mM va 5 mM PPA bilan 24 soatlik davolashdan so'ng cMYC, NRF1 va TFAM ifodasining dozaga bog'liq ravishda pasayishini aniqladik (3a-c-rasm). cMYC ifodasining pasayishi ilgari mitoxondrial stressga javob sifatida xabar qilingan edi42 va aksincha, cMYC ifodasining pasayishi mitoxondrial metabolizmni, tarmoq ulanishini va membrana polyarizatsiyasini qayta tuzish orqali mitoxondrial disfunktsiyaga olib kelishi mumkin43. Qizig'i shundaki, cMYC shuningdek, mitoxondrial bo'linish va sintezni tartibga solishda ishtirok etadi42,43 va hujayra bo'linishi paytida DRP1 fosforillanishini va mitoxondrial lokalizatsiyani kuchaytirishi, shuningdek, neyronal ildiz hujayralarida mitoxondrial morfologik qayta tuzilishni vositachilik qilishi ma'lum45. Darhaqiqat, cMYC yetishmaydigan fibroblastlar PPA43 stressi keltirib chiqaradigan o'zgarishlarga mos keladigan mitoxondrial o'lchamning kamayganligini ko'rsatadi. Ushbu ma'lumotlar cMYC va mitoxondrial dinamika o'rtasidagi qiziqarli, ammo hali noma'lum bog'liqlikni ko'rsatadi, bu esa PPA stressi keltirib chiqaradigan qayta qurish bo'yicha kelajakdagi tadqiqotlar uchun qiziqarli maqsadni ta'minlaydi.
NRF1 va TFAM ning kamayishi cMYC ning muhim transkripsiya aktivatori sifatidagi roliga mos keladi. Bu ma'lumotlar, shuningdek, inson yo'g'on ichak saraton hujayralarida o'tkazilgan avvalgi tadqiqotlar bilan ham mos keladi, bu PPA 22 soat ichida NRF1 mRNA ekspressiyasini kamaytirganligini ko'rsatdi, bu esa ATP kamayishi va ROS46 ning ko'payishi bilan bog'liq edi. Ushbu mualliflar shuningdek, TFAM ekspressiyasi 8,5 soatda oshganini, ammo 22 soatdan keyin boshlang'ich darajaga qaytganini xabar qilishdi. Aksincha, Kim va boshqalar (2019) SH-SY5Y hujayralarida 4 soatlik PPA stressidan keyin TFAM mRNA ekspressiyasi sezilarli darajada kamayganligini ko'rsatdilar; ammo, 72 soatdan keyin TFAM oqsil ekspressiyasi sezilarli darajada oshdi va mtDNK nusxasi soni sezilarli darajada oshdi. Shunday qilib, biz 24 soatdan keyin kuzatgan mitoxondrial biogenez genlari sonining kamayishi mitoxondriallar sonining ko'payishi avvalgi vaqt nuqtalarida biogenezning faollashishi bilan bog'liq bo'lishi mumkinligini istisno qilmaydi. Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, PPA 4 soat 30 daqiqada SH-SY5Y hujayralarida PGC-1α mRNK va oqsilni sezilarli darajada oshiradi, propion kislotasi esa 12 soat 39 daqiqada PGC-1α orqali buzoq gepatotsitlarida mitoxondrial biogenezni kuchaytiradi. Qizig'i shundaki, PGC-1α nafaqat NRF1 va TFAM ning to'g'ridan-to'g'ri transkripsiya regulyatori, balki bo'linish va sintezni tartibga solish orqali MFN2 va DRP1 faolligini tartibga solishi ham ko'rsatilgan47. Birgalikda, bu PPA tomonidan qo'zg'atilgan mitoxondrial kompensator javoblarni tartibga soluvchi mexanizmlarning yaqin bog'liqligini ta'kidlaydi. Bundan tashqari, bizning ma'lumotlarimiz PPA stressi ostida biogenez va metabolizmning transkripsiya regulyatsiyasining sezilarli darajada buzilishini aks ettiradi.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 va DRP1 genlari mitoxondrial bo'linish, sintez va dinamikaning markaziy regulyatorlari qatoriga kiradi37,48,49. Mitoxondrial dinamikada ishtirok etadigan boshqa ko'plab genlar mavjud, ammo STOML2, OPA1 va MFN2 ilgari ASD kohortalarida differentsial metillanganligi aniqlangan,16 va bir nechta mustaqil tadqiqotlar mitoxondrial stressga javoban ushbu transkripsiya omillaridagi o'zgarishlar haqida xabar bergan50,51.52. OPA1 va STOML2 ning ifodasi 3 mM va 5 mM PPA bilan davolash orqali sezilarli darajada kamaydi (3e-rasm, f). OPA1 MFN1 va 2 bilan to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir orqali mitoxondrial sintezning klassik regulyatorlaridan biridir va kristallarni qayta qurish va mitoxondrial morfologiyada rol o'ynaydi53. STOML2 ning mitoxondrial dinamikadagi aniq roli noma'lumligicha qolmoqda, ammo dalillar uning mitoxondrial sintez, biogenez va mitofagiyada rol o'ynashini ko'rsatadi.
STOML2 mitoxondrial nafas olish aloqasini saqlash va nafas olish zanjiri komplekslarini shakllantirishda ishtirok etadi54,55 va saraton hujayralarining metabolik xususiyatlarini chuqur o'zgartirishi ko'rsatilgan56. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, STOML2 BAN va kardiolipin bilan o'zaro ta'sir orqali mitoxondrial membrana potentsiali va biogenezni rag'batlantiradi55, 57, 58. Bundan tashqari, mustaqil tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, STOML2 va PINK1 o'rtasidagi o'zaro ta'sir mitofagiyani tartibga soladi59,60. Shunisi e'tiborga loyiqki, STOML2 MFN2 bilan bevosita o'zaro ta'sir qilishi va uni barqarorlashtirishi, shuningdek, OPA1 parchalanishi uchun mas'ul bo'lgan proteazani inhibe qilish orqali uzoq OPA1 izoformlarini barqarorlashtirishda muhim rol o'ynaydi53,61,62. PPA reaksiyalarida kuzatilgan STOML2 ekspressiyasining pasayishi bu sintez oqsillarini ubikvitin va proteazomaga bog'liq yo'llar orqali parchalanishga ko'proq moyil qilishi mumkin48. STOML2 va OPA1 ning PPA ga dinamik javob berishdagi aniq roli noma'lum bo'lsa-da, bu sintez genlarining ekspressiyasining pasayishi (3-rasm) bo'linish va sintez o'rtasidagi muvozanatni buzishi va mitoxondrial o'lchamning pasayishiga olib kelishi mumkin (3-rasm). 1).
Boshqa tomondan, OPA1 oqsilining ifodalanishi 24 soatdan keyin o'zgarishsiz qoldi, MFN1, MFN2 yoki DRP1 ning mRNK va oqsil darajalari esa PPA bilan davolashdan keyin sezilarli darajada o'zgarmadi (3g-i-rasm, 4-rasm). Bu mitoxondrial sintez va bo'linishda ishtirok etadigan ushbu omillarni boshqarishda hech qanday o'zgarishlar yo'qligini ko'rsatishi mumkin. Biroq, shuni ta'kidlash kerakki, ushbu to'rtta genning har biri oqsil faolligini boshqaruvchi posttranskripsiya modifikatsiyalari (PTM) tomonidan ham tartibga solinadi. OPA1 mitoxondrial sintezda va mitoxondrial tarmoqni saqlashda OPA1 ning rolini oxir-oqibat belgilaydi64. DRP1 faolligi kaltsiy/kalmodulinga bog'liq protein kinaz II (CaMKII) fosforillanishi bilan tartibga solinadi, DRP1 degradatsiyasi esa ubikvitinatsiya va SUMOillanish bilan tartibga solinadi65. Nihoyat, DRP1 va MFN1/2 ikkalasi ham GTPazalardir, shuning uchun faollikka mitoxondriylarda GTP ishlab chiqarish tezligi ta'sir qilishi mumkin 66. Shuning uchun, bu oqsillarning ifodasi doimiy bo'lib qolsa-da, bu o'zgarmagan oqsil faolligi yoki lokalizatsiyasini aks ettirmasligi mumkin 67,68. Darhaqiqat, mavjud PTM oqsil repertuarlari ko'pincha o'tkir stress reaktsiyalarini vositachilik qilish uchun mas'ul bo'lgan birinchi himoya chizig'i bo'lib xizmat qiladi. Bizning modelimizda o'rtacha metabolik stress mavjud bo'lganda, PTM mRNA yoki oqsil darajasida bu genlarni qo'shimcha faollashtirishni talab qilmasdan mitoxondriyal yaxlitlikni etarli darajada tiklash uchun birlashish va bo'linish oqsillarining faolligini oshirishi mumkin.
Yuqoridagi ma'lumotlar birgalikda mitoxondrial morfologiyaning murakkab va vaqtga bog'liq tartibga solinishi va bu mexanizmlarni aniqlashdagi qiyinchiliklarni ta'kidlaydi. Gen ekspressiyasini o'rganish uchun avvalo yo'ldagi aniq maqsadli genlarni aniqlash kerak. Biroq, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, bir xil yo'ldagi genlar bir xil stressga bir xil tarzda javob bermaydi. Aslida, avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, bir xil yo'ldagi turli genlar turli xil vaqtinchalik javob profillarini namoyish qilishi mumkin30,46. Bundan tashqari, transkripsiya va gen funktsiyasi o'rtasidagi munosabatni buzadigan murakkab post-transkripsiya mexanizmlari mavjud. Proteomik tadqiqotlar PTM va oqsil funktsiyasining ta'sirini tushunish imkonini beradi, ammo ular past o'tkazuvchanlik usullari, yuqori signal-shovqin nisbati va yomon aniqlik kabi qiyinchiliklarni ham keltirib chiqaradi.
Shu nuqtai nazardan, TEM va MEL yordamida mitoxondrial morfologiyani o'rganish mitoxondrial dinamika va funksiya o'rtasidagi bog'liqlik va bu kasallikka qanday ta'sir qilishi haqidagi fundamental savollarga javob berish uchun katta salohiyatga ega. Eng muhimi, TEM mitoxondrial disfunktsiya va dinamikaning konvergent so'nggi nuqtasi sifatida mitoxondrial morfologiyani o'lchash uchun to'g'ridan-to'g'ri usulni taqdim etadi51. MEL shuningdek, uch o'lchovli hujayra muhitida bo'linish va sintez hodisalarini vizualizatsiya qilish uchun to'g'ridan-to'g'ri usulni taqdim etadi, bu esa gen ekspressiyasida o'zgarishlar bo'lmagan taqdirda ham dinamik mitoxondrial qayta tuzilishni miqdoriy aniqlash imkonini beradi33. Bu yerda biz ikkilamchi mitoxondrial kasalliklarda mitoxondrial tasvirlash texnikasining foydaliligini ta'kidlaymiz. Bu kasalliklar odatda o'tkir mitoxondrial shikastlanish o'rniga mitoxondrial tarmoqlarning nozik qayta tuzilishi bilan tavsiflangan surunkali yengil metabolik stress bilan tavsiflanadi. Biroq, surunkali stress ostida mitozni saqlab qolish uchun zarur bo'lgan mitoxondrial kompensatsiya chuqur funktsional oqibatlarga olib keladi. Neyroshunoslik nuqtai nazaridan, ushbu kompensator mexanizmlarni yaxshiroq tushunish mitoxondrial disfunktsiya bilan bog'liq pleiotropik neyropatologiya haqida muhim ma'lumotlarni berishi mumkin.
Oxir-oqibat, bizning ma'lumotlarimiz neyron mitoxondrial dinamikasini boshqaradigan gen ekspressiyasi, oqsil modifikatsiyalari va oqsil faolligi o'rtasidagi murakkab o'zaro ta'sirlarning funktsional oqibatlarini tushunish uchun tasvirlash texnikasining foydaliligini ta'kidlaydi. Biz ASD ning mitoxondrial komponentini tushunish uchun neyron hujayra modelida mitoxondrial disfunktsiyani modellashtirish uchun PPA dan foydalandik. PPA bilan davolangan SH-SY5Y hujayralari mitoxondrial morfologiyada o'zgarishlarni ko'rsatdi: mitoxondrial kichik va yumaloq bo'lib qoldi va TEM tomonidan kuzatilganda kristallar yomon aniqlandi. MEL tahlili shuni ko'rsatadiki, bu o'zgarishlar yengil metabolik stressga javoban mitoxondrial tarmoqni saqlab qolish uchun bo'linish va birlashish hodisalarining ko'payishi bilan bir vaqtda sodir bo'ladi. Bundan tashqari, PPA mitoxondrial metabolizm va gomeostazning transkripsiyaviy regulyatsiyasini sezilarli darajada buzadi. Biz cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 va OPA1 ni PPA stressi bilan buzilgan asosiy mitoxondrial regulyatorlar sifatida aniqladik va mitoxondrial morfologiya va funktsiyada PPA tomonidan qo'zg'atilgan o'zgarishlarni vositachilik qilishda rol o'ynashi mumkin. Gen ekspressiyasi va oqsil faolligi, lokalizatsiya va translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalarda PPA tomonidan qo'zg'atilgan vaqtinchalik o'zgarishlarni yaxshiroq tavsiflash uchun kelajakdagi tadqiqotlar zarur. Bizning ma'lumotlarimiz mitoxondrial stressga javob beruvchi tartibga solish mexanizmlarining murakkabligi va o'zaro bog'liqligini ta'kidlaydi va TEM va boshqa tasvirlash texnikalarining yanada maqsadli mexanik tadqiqotlar uchun foydaliligini namoyish etadi.
SH-SY5Y hujayra liniyasi (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrichdan sotib olindi. SH-SY5Y hujayralari Dulbecco'ning modifikatsiyalangan Eagle's muhiti/F-12 ozuqa aralashmasida (DMEM/F-12) va L-glutamin (SC09411, ScienCell) 25 sm2 kolbalarda 20% homila sigir zardobi (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) va 1% penitsillin-streptomitsin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) bilan to'ldirilgan holda 37 °C, 5% CO2 da o'stirildi. Hujayralar 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) yordamida 80% qo'shilishgacha subkultura qilindi, 300 g da santrifuga qilindi va taxminan 7 × 105 hujayra/ml zichlikda qoplandi. Barcha tajribalar 19–22 yo'laklar orasidagi differentsiatsiyalanmagan SH-SY5Y hujayralarida o'tkazildi. PPA NaP sifatida yuboriladi. NaP kukunini (CAS № 137-40-6, kimyoviy formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) iliq MilliQ suvida 1 M konsentratsiyagacha eriting va 4 °C da saqlang. Davolash kunida bu eritmani 1 M PPA bilan 3 mM va 5 mM PPA ga qadar zardobsiz muhitda (L-glutaminli DMEM/F-12) suyultiring. Barcha tajribalar uchun davolash konsentratsiyalari PPA (0 mM, nazorat), 3 mM va 5 mM PPA edi. Tajribalar kamida uchta biologik replikatsiyada o'tkazildi.
SH-SY5Y hujayralari 25 sm5 kolbalarga 5,5 × 105 hujayra/ml tezlikda ekildi va 24 soat davomida o'stirildi. PPA bilan ishlov berish kolbaga 24 soat inkubatsiyadan oldin qo'shildi. Hujayra granulalarini normal sutemizuvchilar to'qimalarining subkulturasi protokollariga muvofiq yig'ing (yuqorida tavsiflangan). Hujayra granulasini 100 µl 2,5% glutaraldegid, 1× PBS da qayta eriting va qayta ishlanmaguncha 4°C da saqlang. SH-SY5Y hujayralari hujayralarni eritish va 2,5% glutaraldegid, 1× PBS eritmasini olib tashlash uchun qisqa vaqtga santrifuga qilindi. Cho'kmani distillangan suvda tayyorlangan 4% agaroza gelida qayta eriting (agarozaning cho'kma hajmiga nisbati 1:1). Agaroza bo'laklari tekis plastinkalardagi panjaralarga joylashtirildi va yuqori bosimli muzlatishdan oldin 1-geksadsen bilan qoplandi. Namunalar 100% quruq asetonda -90°C da 24 soat davomida muzlatildi. Keyin harorat -80°C ga ko'tarildi va 1% osmiy tetroksid va 0,1% glutaraldegid eritmasi qo'shildi. Namunalar -80°C da 24 soat davomida saqlandi. Shundan so'ng, harorat bir necha kun davomida asta-sekin xona haroratiga ko'tarildi: 24 soat davomida – 80 °C dan – 50 °C gacha, 24 soat davomida – 30 °C gacha, 24 soat davomida – 10 °C gacha va nihoyat xona haroratiga.
Kriogen tayyorlashdan so'ng, namunalar qatron bilan singdirildi va Leica Reichert UltracutS ultramikrotomi (Leica Microsystems) yordamida juda yupqa kesmalar (~100 nm) tayyorlandi. Kesmalarga 2% uranil asetat va qo'rg'oshin sitrati qo'shildi. Namunalar 200 kV kuchlanishda ishlaydigan FEI Tecnai 20 uzatish elektron mikroskopi (ThermoFisher (sobiq FEI), Eindhoven, Niderlandiya) (Lab6 uzatgichi) va Tridiem energiya filtri bilan jihozlangan Gatan CCD kamerasi (Gatan, Buyuk Britaniya) yordamida kuzatildi.
Har bir texnik replikatsiyada kamida 24 ta bitta hujayrali tasvirlar olindi, jami 266 ta tasvir. Barcha tasvirlar Qiziqish mintaqasi (ROI) makrosi va Mitoxondriya makrosi yordamida tahlil qilindi. Mitoxondrial makro nashr etilgan usullarga asoslangan17,31,32 va Fiji/ImageJ69 da TEM tasvirlarini yarim avtomatlashtirilgan ommaviy qayta ishlash imkonini beradi. Xulosa qilib aytganda: tasvir teskari va teskari yo'naltiriladi, bunda sharsimon fonni ayirish (60 piksel radius) va FFT tasmali o'tish filtri (mos ravishda 60 va 8 piksel yuqori va pastki chegaralardan foydalangan holda) va 5% yo'nalish tolerantligi bilan vertikal chiziqni bostirish qo'llaniladi. Qayta ishlangan tasvir maksimal entropiya algoritmi yordamida avtomatik ravishda chegaralanadi va ikkilik niqob yaratiladi. Xom TEM tasvirlarida qo'lda tanlangan ROIlar bilan bog'liq tasvir mintaqalari ajratib olindi, mitoxondriyalarni tavsiflaydi va plazma membranasi va boshqa yuqori kontrastli mintaqalarni chiqarib tashlaydi. Har bir ajratib olingan ROI uchun 600 pikseldan kattaroq ikkilik zarrachalar tahlil qilindi va zarrachalar maydoni, perimetri, katta va kichik o'qlari, Feret diametri, yumaloqligi va aylanaligi Fiji/ImageJ ning o'rnatilgan o'lchov funktsiyalari yordamida o'lchandi. Merrill, Flippo va Strack (2017) ga muvofiq, 2-maydon, zarrachalar aspekt nisbati (katta va kichik o'qlar nisbati) va shakl koeffitsienti (FF) ushbu ma'lumotlardan hisoblab chiqildi, bu yerda FF = perimetr 2/4pi x maydon. Parametrik formulaning ta'rifini Merrill, Flippo va Strack (2017) da topish mumkin. Yuqorida aytib o'tilgan makroslar GitHub-da mavjud (Ma'lumotlar mavjudligi bayonotiga qarang). O'rtacha har bir PPA bilan ishlov berishda taxminan 5600 zarracha tahlil qilindi, jami taxminan 17000 zarracha (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).
SH-SH5Y hujayralari bir kecha davomida yopishishini ta'minlash uchun 8 kamerali madaniyat idishlariga (ThermoFisher, #155411) joylashtirildi va keyin TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) va Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) bilan inkubatsiya qilindi. Bo'yash. Tasvirlar 10 daqiqalik muhitda 405 nm va 561 nm lazerlar yordamida olindi va xom tasvirlar keyingi 12 vaqt nuqtasida tasvir kadrlari orasida 0,2 μm az bosqichli 10 ta tasvir mikrograflarini o'z ichiga olgan z-stacklar sifatida olindi. Tasvirlar Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super aniqlikdagi platformasi (Carl Zeiss, Oberkochen, Germaniya) yordamida LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 linzalari yordamida to'plandi. Tasvirlar ImageJ da avval tasvirlangan quvur liniyasi va ImageJ plagini yordamida tahlil qilindi, bunda sintez va bo'linish hodisalari, mitoxondrial tuzilmalarning o'rtacha soni va har bir hujayra uchun o'rtacha mitoxondrial hajm o'lchandi33. MEL makroslari GitHub'da mavjud (Ma'lumotlar mavjudligi to'g'risidagi bayonotga qarang).
SH-SY5Y hujayralari oltita chuqurchali plastinkalarda 0,3 × 106 hujayra/ml zichlikda ishlov berishdan oldin 24 soat davomida o'stirildi. RNK Quick-RNA™ Miniprep protokoli (ZR R1055, Zymo Research) yordamida ozgina o'zgartirishlar bilan ekstraksiya qilindi: olib tashlashdan oldin har bir chuqurchaga 300 mkl RNK lizis buferi qo'shing va har bir namunani oxirgi bosqich sifatida 30 mkl DNase/RNase elyutsiyasiz suv bilan lizis qiling. Barcha namunalar NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotometri yordamida miqdori va sifati tekshirildi. Hujayra lizatlaridan olingan umumiy oqsil 200 mkl RIPA lizis buferi yordamida olindi va oqsil konsentratsiyasi Bradford oqsil tahlili yordamida aniqlandi70.
kDNK sintezi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, ba'zi o'zgartirishlar bilan Tetro™ kDNK sintez to'plami (BIO-65043, Meridian Bioscience) yordamida amalga oshirildi. kDNK 20 mkl reaksiyalarda 0,7 dan 1 mkg gacha umumiy RNK yordamida sintez qilindi. Primerlar ilgari nashr etilgan 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78-sonli maqolalardan (S1-jadval) tanlab olindi va unga hamroh bo'lgan zondlar Integrated DNA Technologies kompaniyasining PrimerQuest vositasi yordamida ishlab chiqildi. Barcha qiziqish uyg'otadigan genlar yadroviy B2M geniga normallashtirildi. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC va OPA1 genlarining ifodasi RT-qPCR yordamida o'lchandi. Asosiy aralashma tarkibiga LUNA Taq polimeraza (M3003L, New England Biolabs), 10 μM oldinga va teskari primerlar, kDNK va PCR darajasidagi suv kiritilgan bo'lib, har bir reaksiya uchun 10 μL yakuniy hajm hosil bo'ldi. Bo'linish va bo'linish genlarining ifodasi (DRP1, MFN1/2) TaqMan multipleks tahlillari yordamida o'lchandi. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq kichik o'zgartirishlar bilan ishlatilgan. Multipleks RT-qPCR asosiy aralashmasi 1X LUNA Taq polimeraza, 10 μM oldinga va teskari primerlar, 10 μM zond, kDNK va PCR darajasidagi suvni o'z ichiga oladi, natijada har bir reaksiya uchun 20 μL yakuniy hajm hosil bo'ldi. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — seriya raqami: R0618110) yordamida amalga oshirildi. Sikl sharoitlari S1 jadvalida ko'rsatilgan. Barcha kDNK namunalari uch marta ko'paytirildi va o'n marta suyultirish ketma-ketligi yordamida standart egri chiziq hosil qilindi. Ma'lumotlarning takrorlanuvchanligini ta'minlash uchun sikl chegarasi standart og'ishi (Ct) >0,5 bo'lgan uch marta namunalardagi chetga chiqishlar tahlildan olib tashlandi30,72. Nisbiy gen ekspressiyasi 2-ΔΔCt79 usuli yordamida hisoblab chiqildi.
Oqsil namunalari (60 mkg) Laemmli yuklash buferi bilan 2:1 nisbatda aralashtirildi va 12% rangsiz oqsil gelida (Bio-Rad #1610184) ishladi. Oqsillar Trans-Blot Turbo tizimi (#170-4155, Bio-Rad) yordamida PVDF (poliviniliden ftorid) membranasiga (#170-84156, Bio-Rad) o'tkazildi. Membrana bloklandi va tegishli birlamchi antikorlar (OPA1, MFN1, MFN2 va DRP1) bilan 48 soat davomida inkubatsiya qilindi (1:1000 suyultirildi), so'ngra ikkilamchi antikorlar (1:10,000) bilan 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Keyin membranalar Clarity Western ECL substrati (#170-5061, Bio-Rad) yordamida tasvirga olindi va Bio-Rad ChemiDoc MP tizimi yordamida yozib olindi. Western blot tahlili uchun ImageLab 6.1 versiyasi ishlatilgan. Asl gel va blot S1-rasmda ko'rsatilgan. Antikorlar haqida ma'lumot S2-jadvalda keltirilgan.
Ma'lumotlar to'plamlari kamida uchta mustaqil namunaning o'rtacha qiymati va standart xatosi (SEM) sifatida taqdim etiladi. Ma'lumotlar to'plamlari Gauss taqsimoti va teng standart og'ishlarni qabul qilishdan va tahlillarni davom ettirishdan oldin Shapiro-Wilks testi yordamida normallik uchun sinovdan o'tkazildi (agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa). Ma'lumotlar to'plamini tahlil qilishdan tashqari, Fisherning MEL LSD (p < 0.05), bir tomonlama ANOVA (davolash va nazorat o'rtacha qiymati) va Dunnettning ahamiyatini aniqlash uchun ko'p taqqoslash testi (p < 0.05) qo'llanildi. Muhim p qiymatlari grafikda *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 sifatida ko'rsatilgan. Barcha statistik tahlillar va grafiklar GraphPad Prism 9.4.0 yordamida amalga oshirildi va yaratildi.
TEM tasvir tahlili uchun Fiji/ImageJ makroslari GitHub’da ommaga ochiq: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitoxondrial hodisalarni aniqlash moslamasi (MEL) makrosi GitHub’da ommaga ochiq: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM va Vijaya A. Mitoxondriyalar: metabolizm, gomeostaz, stress, qarish va epigenetikaning asosiy regulyatorlari. Indoneziyalik. Biotibbiyot fanlari. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Shizofreniyadagi ko'p qirrali mitoxondriyal disfunktsiya, I kompleksi mumkin bo'lgan patologik nishon sifatida. Shizofreniya. resurs. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. va Beal, MF Parkinson kasalligida mitoxondrial disfunktsiya. J. Neyrokimyo. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG va Mehta V. Stressli mitoxondriyalar: Altsgeymer kasalligida invaziya nishonlari. Mitoxondriya 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF va Ferreira GK Mitoxondriya va miya: bioenergetika va boshqalar. Neyrotoksinlar. resurs. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. va boshqalar. Pleiotrop mitoxondriyalar: mitoxondriyalarning neyronlarning rivojlanishi va kasalliklariga ta'siri. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardano-Ramos, C. va Morais, VA Neyronlarda mitoxondrial biogenez: qanday va qayerda. xalqarolik. J. Mohr. fan. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. va Zhao, J. Sutemizuvchilar mitoxondriyal dinamikasini tartibga solish: imkoniyatlar va qiyinchiliklar. front. endokrin. (Lozanna) 11, 374 (2020).
Khacho, M. va Slack, RS Neyrogenezni boshqarishda mitoxondrial dinamika: rivojlanayotgan miyadan kattalar miyasigacha. rivojlanish. dinamik. 247, 47–53 (2018).