Hozirgi *Hozirgi manzil: Köln 50931, Germaniya, Qarish bilan bog'liq kasalliklarda hujayra stressiga javob berish bo'yicha Köln mukammallik klaster tadqiqoti (CECAD).
Mitoxondrial kasalliklarning neyrodegeneratsiyasi qaytarib bo'lmaydigan deb hisoblanadi, chunki neyronlarning metabolik plastikligi cheklangan, ammo mitoxondrial disfunktsiyaning organizmdagi neyron metabolizmining hujayra avtonomiyasiga ta'siri yaxshi tushunilmagan. Bu yerda biz mitoxondrial sintez dinamikasining buzilishi natijasida yuzaga kelgan progressiv OXPHOS yetishmovchiligi bo'lgan Purkinje neyronlarining hujayraga xos proteomini taqdim etamiz. Biz mitoxondrial disfunktsiya proteomika sohasida chuqur o'zgarishlarni keltirib chiqarganini aniqladik, bu oxir-oqibat hujayra o'limidan oldin aniq metabolik dasturlarning ketma-ket faollashishiga olib keldi. Kutilmaganda, biz piruvat karboksilaza (PCx) va TCA siklining oraliq mahsulotlarini to'ldiruvchi boshqa qarishga qarshi fermentlarning aniq induksiyasi aniqlandi. PCx ning inhibatsiyasi oksidlovchi stress va neyrodegeneratsiyani kuchaytirdi, bu ateroskleroz OXPHOSga ega bo'lmagan neyronlarda himoya ta'siriga ega ekanligini ko'rsatadi. Terminal degeneratsiyalangan neyronlarda mitoxondrial sintezning tiklanishi bu metabolik xususiyatlarni butunlay o'zgartiradi va shu bilan hujayra o'limining oldini oladi. Bizning topilmalarimiz mitoxondrial disfunktsiyaga chidamlilikni ta'minlaydigan ilgari noma'lum yo'llarni aniqlaydi va neyrodegeneratsiyani kasallikning kech bosqichlarida ham qaytarish mumkinligini ko'rsatadi.
Mitoxondriyal energiya almashinuvini saqlab qolishdagi mitoxondriyallarning markaziy roli inson mitoxondriyal kasalliklari bilan bog'liq keng qamrovli nevrologik alomatlar bilan ta'kidlangan. Ushbu kasalliklarning aksariyati mitoxondriyal gen ekspressiyasini tartibga soluvchi gen mutatsiyalari (1, 2) yoki mitoxondriyal dinamika bilan bog'liq genlarning yo'q qilinishi natijasida yuzaga keladi, bu esa bilvosita mitoxondriyal DNK (mtDNK) barqarorligiga ta'sir qiladi (3, 4). Hayvon modellarida olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, atrofdagi to'qimalarda mitoxondriyal disfunktsiyaga javoban konservativ metabolik yo'llar (5-7) faollashishi mumkin, bu esa ushbu murakkab kasalliklarning patogenezini chuqur tushunish uchun muhim ma'lumotlarni beradi. Aksincha, miya mitoxondriyal adenozin trifosfat (ATP) ishlab chiqarishning umumiy muvaffaqiyatsizligi natijasida kelib chiqadigan ma'lum hujayra turlarining metabolik o'zgarishlarini tushunishimiz asosiy hisoblanadi (8), bu kasalliklarning oldini olish yoki oldini olish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan terapevtik maqsadlarni aniqlash zarurligini ta'kidlaydi. Neyrodegeneratsiyaning oldini olish (9). Axborotning etishmasligi shundaki, asab hujayralari atrofdagi to'qimalarning hujayra turlariga nisbatan juda cheklangan metabolik moslashuvchanlikka ega deb hisoblanadi (10). Ushbu hujayralar sinaptik uzatishni rag'batlantirish va shikastlanish va kasallik holatlariga javob berish uchun neyronlarga metabolitlar yetkazib berishni muvofiqlashtirishda markaziy rol o'ynashini hisobga olsak, hujayra metabolizmini miya to'qimalarining qiyin sharoitlariga moslashtirish qobiliyati deyarli glial hujayralar bilan cheklangan (11-14). Bundan tashqari, miya to'qimalarining o'ziga xos hujayrali heterojenligi ma'lum neyron kichik guruhlarida sodir bo'ladigan metabolik o'zgarishlarni o'rganishga katta darajada to'sqinlik qiladi. Natijada, neyronlarda mitoxondriyal disfunktsiyaning aniq hujayrali va metabolik oqibatlari haqida kam narsa ma'lum.
Mitoxondriyal disfunktsiyaning metabolik oqibatlarini tushunish uchun biz mitoxondriyal tashqi membrana birikishining (Mfn2) yo'q qilinishi natijasida kelib chiqadigan neyrodegeneratsiyaning turli bosqichlarida Purkinje neyronlarini (PN) ajratib oldik. Odamlarda Mfn2 mutatsiyalari Charcot-Marie-Tooth 2A turi (15) deb nomlanuvchi irsiy motorli sensor neyropatiya shakli bilan bog'liq bo'lsa-da, sichqonlarda Mfn2 ning shartli yo'q qilinishi oksidlanishning fosforillanish (OXPHOS) disfunktsiya usulining yaxshi tan olingan induksiyasi hisoblanadi. Turli neyronal subtiplar (16-19) va natijada paydo bo'lgan neyrodegenerativ fenotip harakat buzilishlari (18, 19) yoki serebellar ataksiya (16) kabi progressiv nevrologik alomatlar bilan birga keladi. Yorliqsiz miqdoriy (LFQ) proteomika, metabolomika, tasvirlash va virusologik usullarning kombinatsiyasidan foydalanib, biz progressiv neyrodegeneratsiya piruvat karboksilaza (PCx) va PNlarning in vivo arteriosklerozida ishtirok etadigan boshqa omillarni kuchli ravishda qo'zg'atishini ko'rsatamiz. Fermentlarning ifodasi. Ushbu topilmaning dolzarbligini tekshirish uchun biz Mfn2 yetishmaydigan PNlarda PCx ekspressiyasini maxsus ravishda pasaytirdik va bu operatsiya oksidlovchi stressni kuchaytirganini va neyrodegeneratsiyani tezlashtirganini aniqladik, shu bilan azoospermiya hujayra o'limiga metabolik moslashuvchanlikni berishini isbotladi. MFN2 ning og'ir ekspressiyasi og'ir OXPHOS yetishmovchiligi, mitoxondrial DNKning katta miqdorda iste'mol qilinishi va aftidan uzilgan mitoxondrial tarmoq bilan terminal degeneratsiya PN ni to'liq qutqarishi mumkin, bu esa neyrodegeneratsiyaning bu shakli hatto hujayra o'limidan oldin kasallikning rivojlangan bosqichida ham tiklanishi mumkinligini ta'kidlaydi.
Mfn2 nokaut PNlaridagi mitoxondriyalarni vizualizatsiya qilish uchun biz Cre-ga bog'liq mitoxondriyalarga sariq lyuminestsent oqsilni (YFP) (mtYFP) (20) Cre ifodasini nishonga olish imkonini beruvchi sichqoncha shtammidan foydalandik va mitoxondrial morfologiyani in vivo tekshirdik. Biz PNlarda Mfn2 genining yo'q qilinishi mitoxondrial tarmoqning asta-sekin bo'linishiga olib kelishini aniqladik (S1A-rasm) va eng erta o'zgarish 3 haftalik yoshda aniqlandi. Aksincha, Calbindin immunobo'yashining yo'qolishi bilan tasdiqlanganidek, PN hujayra qatlamining sezilarli darajada degeneratsiyasi 12 haftalik yoshgacha boshlanmadi (1-rasm, A va B). Mitoxondrial morfologiyadagi eng erta o'zgarishlar va neyronlar o'limining ko'rinadigan boshlanishi o'rtasidagi vaqt nomuvofiqligi bizni hujayra o'limidan oldin mitoxondrial disfunktsiya tomonidan qo'zg'atilgan metabolik o'zgarishlarni tekshirishga undadi. Biz YFP (YFP+) ifodalovchi PN ni ajratish uchun lyuminestsent faollashtirilgan hujayralarni saralash (FACS) asosidagi strategiyani ishlab chiqdik (1C-rasm) va nazorat sichqonlarida (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), bundan keyin CTRL deb ataladi (S1B-rasm). YFP signalining nisbiy intensivligiga asoslangan darvoza strategiyasini optimallashtirish bizga YFP+ tanasini (YFPhigh) PN dan PN bo'lmaganlardan (YFPneg) (S1B-rasm) yoki taxminiy lyuminestsent akson/dendritik fragmentlardan (YFPlow; S1D-rasm, chapda) tozalash imkonini beradi, bu konfokal mikroskop bilan tasdiqlangan (S1D-rasm, o'ngda). Tasniflangan populyatsiyaning identifikatsiyasini tekshirish uchun biz LFQ proteomikasini va keyin asosiy komponent tahlilini o'tkazdik va YFPhigh va YFPneg hujayralari o'rtasida aniq farq borligini aniqladik (S1C-rasm). YFPhigh hujayralari ma'lum PN markerlarining (ya'ni Calb1, Pcp2, Grid2 va Itpr3) sof boyitishini ko'rsatdi (21, 22), ammo neyronlarda yoki boshqa hujayra turlarida keng tarqalgan oqsillarning boyitilishi kuzatilmadi (1D-rasm). Mustaqil tajribalarda to'plangan tasniflangan YFPhigh hujayralaridagi namunalar o'rtasidagi taqqoslash korrelyatsiya koeffitsienti > 0,9 ni ko'rsatdi, bu biologik replikalar o'rtasida yaxshi takrorlanuvchanlikni ko'rsatdi (S1E-rasm). Xulosa qilib aytganda, bu ma'lumotlar mumkin bo'lgan PN ni o'tkir va o'ziga xos izolyatsiya qilish rejamizni tasdiqladi. Foydalanilgan L7-cre drayver tizimi tug'ruqdan keyingi birinchi haftada mozaik rekombinatsiyani keltirib chiqarganligi sababli (23), biz CTRL va shartli (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neyronlarini yig'ishdan sichqonlarni yo'q qilishni boshladik. Rekombinatsiya tugagandan so'ng, u 4 haftalik yoshda Mfn2cKO deb ataladi. Yakuniy nuqta sifatida biz mitoxondrial parchalanishga qaramay, PN qatlami butun bo'lgan 8 haftalik yoshni tanladik (1B-rasm va S1A-rasm). Jami 3013 ta oqsilni miqdoriy jihatdan aniqladik, ulardan taxminan 22% mitoxondrial proteomni mitoxondrial sifatida ko'rsatishga asoslangan MitoCarta 2.0 annotatsiyalariga asoslangan (1E-rasm) (1E-rasm) (24). 8-haftada o'tkazilgan differentsial gen ekspressiyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, barcha oqsillarning atigi 10,5% da sezilarli o'zgarishlar bo'lgan (1F-rasm va S1F-rasm), ulardan 195 tasi pastga va 120 tasi yuqoriga ko'tarilgan (1F-rasm). Shuni ta'kidlash kerakki, ushbu ma'lumotlar to'plamining "innovatsion yo'l tahlili" differentsial ifodalangan genlar asosan cheklangan ma'lum metabolik yo'llar to'plamiga tegishli ekanligini ko'rsatadi (1G-rasm). Qizig'i shundaki, OXPHOS va kaltsiy signalizatsiyasi bilan bog'liq yo'llarning pastga regulyatsiyasi termoyadroviy yetishmovchilikli PNlarda mitoxondrial disfunktsiyaning induktsiyasini tasdiqlasa-da, asosan aminokislotalar metabolizmini o'z ichiga olgan boshqa toifalar sezilarli darajada yuqoriroq tartibga solinadi, bu esa mitoxondrial PNlarda sodir bo'ladigan metabolizmga mos keladi. Qayta simlash izchil disfunktsiyaga ega.
(A) CTRL va Mfn2cKO sichqonlarining serebellar kesimlarining vakillik konfokal fotosuratlari PNlarning progressiv yo'qolishini ko'rsatadi (kalbindin, kulrang); yadrolar DAPI bilan qarama-qarshi bo'yalgan. (B) (A) ning miqdorini aniqlash (dispersiyaning bir tomonlama tahlili, ***P<0.001; n = uchta sichqondan 4 dan 6 gacha doiralar). (C) Eksperimental ish jarayoni. (D) Purkinje (yuqori) va boshqa hujayra turlariga (o'rta) xos markerlarning issiqlik xaritasi taqsimoti. (E) Tasniflangan PNda aniqlangan mitoxondrial oqsillar sonini ko'rsatuvchi Venn diagrammasi. (F) 8 haftada Mfn2cKO neyronlarida differentsial ifodalangan oqsillarning vulqon diagrammasi (ahamiyat chegarasi 1.3). (G) Ijodkorlik yo'li tahlili 8 hafta sifatida tasniflangan Mfn2cKO PNdagi eng muhim beshta yuqoriga ko'tarilish (qizil) va pastga ko'tarilish (ko'k) yo'llarini ko'rsatadi. Aniqlangan har bir oqsilning o'rtacha ifoda darajasi ko'rsatilgan. Kulrang issiqlik xaritasi: sozlangan P qiymati. ns, muhim emas.
Proteomika ma'lumotlari shuni ko'rsatdiki, I, III va IV komplekslarining oqsil ekspressiyasi asta-sekin pasaygan. I, III va IV komplekslarining barchasida mtDNK bilan kodlangan muhim subbirliklar mavjud edi, faqat yadro bilan kodlangan II kompleks esa deyarli ta'sirlanmagan (2A-rasm va S2A-rasm). . Proteomika natijalariga muvofiq, serebellar to'qima bo'limlarining immunohistokimyosi shuni ko'rsatdiki, PNdagi IV kompleksning MTCO1 (mitoxondrial sitoxrom C oksidaza subbirligi 1) subbirligi darajasi asta-sekin pasaygan (2B-rasm). mtDNK bilan kodlangan Mtatp8 subbirligi sezilarli darajada kamaydi (S2A-rasm), yadro bilan kodlangan ATP sintaza subbirligining barqaror holati o'zgarishsiz qoldi, bu mtDNK ekspressiyasi barqaror bo'lganda ma'lum bo'lgan barqaror ATP sintaza subyekti F1 kompleksiga mos keladi. Shakllanish izchil. Interrupt (7). Saralangan Mfn2cKO PNlaridagi mtDNK darajasini real vaqt polimeraza zanjiri reaksiyasi (qPCR) yordamida baholash mtDNK nusxa sonining asta-sekin kamayishini tasdiqladi. Nazorat guruhi bilan taqqoslaganda, 8 haftalik yoshda mtDNK darajasining atigi 20% saqlanib qolgan (2C-rasm). Ushbu natijalarga muvofiq, DNKni aniqlash uchun Mfn2cKO PNlarining konfokal mikroskopiya bo'yalishi qo'llanildi, bu mitoxondrial nukleotidlarning vaqtga bog'liq iste'molini ko'rsatdi (2D-rasm). Biz mitoxondrial oqsil degradatsiyasi va stressga javob berishda ishtirok etadigan ba'zi nomzodlar, jumladan, Lonp1, Afg3l2 va Clpx va OXPHOS kompleks yig'ish omillari yuqori darajada tartibga solinganligini aniqladik. Apoptozda ishtirok etadigan oqsillar darajasida sezilarli o'zgarishlar aniqlanmadi (S2B-rasm). Xuddi shunday, biz kaltsiy tashishda ishtirok etadigan mitoxondriyalar va endoplazmatik retikulum kanallarida ham kichik o'zgarishlar borligini aniqladik (S2C-rasm). Bundan tashqari, autofagiya bilan bog'liq oqsillarni baholashda sezilarli o'zgarishlar aniqlanmadi, bu immunohistokimyo va elektron mikroskopiya orqali in vivo kuzatilgan autofagosomalarning ko'rinadigan induksiyasi bilan mos keladi (S3-rasm). Biroq, PNlardagi progressiv OXPHOS disfunktsiyasi aniq ultrastrukturaviy mitoxondrial o'zgarishlar bilan birga keladi. 5 va 8 haftalik Mfn2cKO PNlarning hujayra tanalari va dendritik daraxtlarida mitoxondrial klasterlarni ko'rish mumkin va ichki membrana tuzilishi chuqur o'zgarishlarga uchradi (S4, A va B-rasmlar). Ushbu ultrastrukturaviy o'zgarishlar va mtDNKning sezilarli darajada pasayishiga muvofiq, tetrametilrodamin metil efiri (TMRM) bilan o'tkir miya serebellar bo'laklarini tahlil qilish Mfn2cKO PNlardagi mitoxondrial membrana potensiali sezilarli darajada pasayganligini ko'rsatdi (S4C-rasm).
(A) OXPHOS kompleksining ifoda darajasining vaqt tahlili. Faqat 8 haftada P<0.05 bo'lgan oqsillarni ko'rib chiqing (ikki tomonlama ANOVA). Nuqtali chiziq: CTRL bilan solishtirganda sozlash yo'q. (B) Chapda: Anti-MTCO1 antitelosi bilan belgilangan serebellar kesimiga misol (shkala chizig'i, 20 μm). Purkinje hujayra tanalari egallagan maydon sariq rang bilan qoplangan. O'ngda: MTCO1 darajasini miqdorlash (dispersiyaning bir tomonlama tahlili; uchta sichqondan tahlil qilingan n = 7 dan 20 gacha hujayralar). (C) Saralangan PNdagi mtDNK nusxasi sonining qPCR tahlili (dispersiyaning bir tomonlama tahlili; n = 3 dan 7 gacha sichqonlar). (D) Chapda: Anti-DNK antitelosi bilan belgilangan serebellar kesimiga misol (shkala chizig'i, 20 μm). Purkinje hujayra tanalari egallagan maydon sariq rang bilan qoplangan. O'ngda: mtDNK lezyonlarining miqdorini aniqlash (dispersiyaning bir tomonlama tahlili; n = uchta sichqondan 5 dan 9 gacha hujayralar). (E) Butun hujayrali yamoq qisqichi yozuvida mitoYFP + Purkinje hujayralarini ko'rsatuvchi o'tkir serebellar kesimiga misol (strelka). (F) IV egri chizig'ini miqdorini aniqlash. (G) CTRL va Mfn2cKO Purkinje hujayralarida depolyarizatsiya qiluvchi tok in'ektsiyasining vakillik yozuvlari. Yuqori iz: APni ishga tushirgan birinchi impuls. Pastki iz: Maksimal AP chastotasi. (H) Postsinaptik spontan kirishlarning (sPSP) miqdorini aniqlash. Vakillik yozuv izi va uning kattalashtirish nisbati (I) da ko'rsatilgan. Uch sichqondan n = 5 dan 20 gacha hujayralarni tahlil qilgan bir tomonlama dispersiya tahlili. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Teshilgan yamoq qisqichi rejimi yordamida qayd etilgan spontan APning vakillik izlari. Yuqori iz: Maksimal AP chastotasi. Pastki iz: bitta APning kattalashtirishi. (K) O'rtacha va maksimal AP chastotasini (J) ga muvofiq aniqlang. Mann-Whitney testi; to'rtta sichqondan olingan n = 5 hujayra tahlil qilindi. Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi; muhim emas.
8 haftalik Mfn2cKO PN da aniq OXPHOS shikastlanishi aniqlandi, bu neyronlarning fiziologik funktsiyasi jiddiy darajada anormal ekanligini ko'rsatadi. Shuning uchun, biz 4-5 hafta va 7-8 haftalarda o'tkir serebellar bo'laklarida butun hujayrali yamoq qisqichlarini yozib olish orqali OXPHOS yetishmaydigan neyronlarning passiv elektr xususiyatlarini tahlil qildik (2E-rasm). Kutilmaganda, Mfn2cKO neyronlarining o'rtacha dam olish membranasi potensiali va kirish qarshiligi nazorat guruhiga o'xshash edi, garchi hujayralar o'rtasida nozik farqlar mavjud bo'lsa ham (1-jadval). Xuddi shunday, 4-5 haftalik yoshda tok-kuchlanish munosabatida (IV egri chizig'i) sezilarli o'zgarishlar topilmadi (2F-rasm). Biroq, 7-8 haftalik Mfn2cKO neyronlari IV rejimidan (giperpolyarizatsiya bosqichi) omon qolmadi, bu esa ushbu kech bosqichda giperpolyarizatsiya potensialiga aniq sezgirlik borligini ko'rsatadi. Aksincha, Mfn2cKO neyronlarida takroriy ta'sir potensiali (AP) razryadlarini keltirib chiqaradigan depolyarizatsiya qiluvchi toklarga yaxshi muhosaba qilinadi, bu ularning umumiy razryad naqshlari 8 haftalik nazorat neyronlarinikidan sezilarli darajada farq qilmasligini ko'rsatadi (1-jadval va 2G-rasm). Xuddi shunday, spontan postsinaptik toklarning (sPSC) chastotasi va amplitudasi nazorat guruhidagilarga o'xshash edi va hodisalar chastotasi shunga o'xshash o'sish bilan 4 haftadan 5 haftagacha, 7 haftadan 8 haftagacha oshdi (2-rasm, H va I). ​​PNlarda sinaptik yetilish davri (25). Shunga o'xshash natijalar teshilgan PN yamalaridan keyin olingan. Ushbu konfiguratsiya butun hujayrali yama qisqichini yozib olishda bo'lgani kabi, hujayra ATP nuqsonlarining mumkin bo'lgan kompensatsiyasini oldini oladi. Xususan, Mfn2cKO neyronlarining dam olish membranasining potensiali va spontan otilish chastotasi ta'sirlanmagan (2-rasm, J va K). Xulosa qilib aytganda, bu natijalar aniq OXPHOS disfunktsiyasiga ega bo'lgan PNlar yuqori chastotali razryad naqshlariga yaxshi bardosh bera olishini ko'rsatadi, bu ularga deyarli normal elektrofiziologik javoblarni saqlab qolish imkonini beruvchi kompensatsiya mexanizmi mavjudligini ko'rsatadi.
Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM (dispersiyaning bir tomonlama tahlili, Holm-Sidakning ko'p tomonlama taqqoslash testi; *P<0.05) sifatida ifodalanadi. Birlik raqami qavs ichida ko'rsatilgan.
Biz proteomika ma'lumotlar to'plamidagi biron bir kategoriya (1G-rasm) OXPHOSning og'ir yetishmovchiligiga qarshi tura oladigan yo'llarni o'z ichiga oladimi yoki yo'qligini tekshirishga kirishdik va shu bilan ta'sirlangan PN nima uchun normal elektrofiziologiyani saqlab qolishi mumkinligini tushuntirdik (2-rasm, E dan K gacha). . Proteomika tahlili shuni ko'rsatdiki, tarmoqlangan zanjirli aminokislotalar (BCAA) katabolizmida ishtirok etadigan fermentlar sezilarli darajada yuqori darajada tartibga solingan (3A-rasm va S5A-rasm) va yakuniy mahsulot asetil-CoA (CoA) yoki suksinil CoA arterioskleroz kislotasi (TCA) siklidagi trikarboksilatlarni to'ldirishi mumkin. Biz BCAA transaminaza 1 (BCAT1) va BCAT2 miqdorining ikkalasi ham oshganini aniqladik. Ular α-ketoglutaratdan glutamat hosil qilish orqali BCAA katabolizmining birinchi bosqichini katalizlaydi (26). Tarmoqlangan zanjirli keto kislotali dehidrogenaza (BCKD) kompleksini tashkil etuvchi barcha subbirliklar yuqori regulyatsiyaga uchraydi (kompleks hosil bo'lgan BCAA uglerod skeletining keyingi va qaytarib bo'lmaydigan dekarboksillanishini katalizlaydi) (3A-rasm va S5A-rasm). Biroq, saralangan PNda BCAA ning o'zida aniq o'zgarishlar topilmadi, bu ushbu muhim aminokislotalarning hujayra tomonidan qabul qilinishining ortishi yoki TCA siklini to'ldirish uchun boshqa manbalardan (glyukoza yoki sut kislotasi) foydalanish bilan bog'liq bo'lishi mumkin (S5B-rasm). OXPHOSga ega bo'lmagan PNlarda ham 8 haftalik yoshda glutamin parchalanishi va transaminatsiya faolligining ortishi kuzatildi, bu mitoxondrial fermentlar glutaminaza (GLS) va glutamin piruvat transaminaza 2 (GPT2) ning yuqori regulyatsiyasi bilan aks ettirilishi mumkin (3-rasm, A va C). Shuni ta'kidlash kerakki, GLS ning yuqori regulyatsiyasi spliced ​​​​izoform glutaminaza C (GLS-GAC) bilan cheklangan (Mfn2cKO/CTRL ning o'zgarishi taxminan 4,5 baravar, P = 0,05) va uning saraton to'qimalarida o'ziga xos yuqori regulyatsiyasi mitoxondrial bioenergiyani qo'llab-quvvatlashi mumkin. (27).
(A) Issiqlik xaritasi 8 hafta davomida belgilangan yo'l uchun oqsil darajasining o'zgarishini ko'rsatadi. (B) Anti-PCx antitelosi bilan belgilangan serebellar bo'lagining namunasi (shkala chizig'i, 20 μm). Sariq strelka Purkinje hujayra tanasiga ishora qiladi. (C) Ateroskleroz uchun muhim nomzod sifatida aniqlangan vaqt kursi oqsilining ifodalanish tahlili (ko'p t-test, *FDR <5%; n = 3-5 sichqon). (D) Yuqorida: [1-13C]piruvat izlovchisida mavjud bo'lgan belgilangan uglerodni kiritishning turli usullarini ko'rsatuvchi sxematik diagramma (ya'ni, PDH yoki trans-arterial yo'l orqali). Pastki qismida: Skripka jadvalida o'tkir serebellar bo'laklari [1-13C]piruvat bilan belgilangandan so'ng aspartik kislota, limon kislotasi va olma kislotasiga aylantirilgan bitta belgilangan uglerodning (M1) foizi ko'rsatilgan (juft t-test; ** P <0.01). (E) Ko'rsatilgan yo'lning vaqt tarixini kompleks tahlil qilish. Faqat 8 haftada P<0,05 bo'lgan oqsillarni ko'rib chiqing. Nuqta chiziq: sozlash qiymati yo'q (dispersiyaning ikki tomonlama tahlili; * P <0,05; *** P <0,001). Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi.
Bizning tahlilimizda BCAA katabolizmi asosiy yuqoriga ko'tarilish yo'llaridan biriga aylandi. Bu fakt TCA sikliga kiradigan shamollatish hajmi OXPHOS bo'lmagan PNda o'zgarishi mumkinligini kuchli ko'rsatadi. Bu neyron metabolik qayta ulanishning asosiy shakli bo'lishi mumkin, bu esa og'ir OXPHOS disfunktsiyasini saqlab qolish paytida neyron fiziologiyasi va omon qolishga bevosita ta'sir qilishi mumkin. Ushbu gipotezaga muvofiq, biz asosiy antiaterosklerotik ferment PCx yuqoriga ko'tarilganligini aniqladik (Mfn2cKO/CTRL taxminan 1,5 marta o'zgaradi; 3A-rasm), bu piruvatning oksaloatsetatga aylanishini katalizlaydi (28), bu miya to'qimasida deb hisoblanadi. In ifodasi astrositlar bilan cheklangan (29, 30). Proteomika natijalariga muvofiq, konfokal mikroskopiya shuni ko'rsatdiki, PCx ifodasi OXPHOS yetishmaydigan PNlarda aniq va sezilarli darajada oshgan, PCx reaktivligi esa asosan nazorat guruhining qo'shni Bergmann glial hujayralari bilan cheklangan (3B-rasm). PCx ning kuzatilgan yuqori regulyatsiyasini funktsional jihatdan tekshirish uchun biz o'tkir serebellar bo'laklarini [1-13C]piruvat izoter bilan davoladik. Piruvat piruvatdegidrogenaza (PDH) tomonidan oksidlanganda, uning izotop yorlig'i yo'qoldi, ammo piruvat qon tomir reaksiyalari orqali metabolizmga uchraganda TCA sikli oraliq mahsulotlariga qo'shiladi (3D-rasm). Proteomika ma'lumotlarimizni qo'llab-quvvatlash uchun biz Mfn2cKO bo'laklarining aspartik kislotasida ushbu izoterdan ko'p sonli markerlarni kuzatdik, limon kislotasi va olma kislotasi ham sezilarli bo'lmasa-da, o'rtacha tendentsiyaga ega edi (3D-rasm).
MitoPark sichqonlarining dopamin neyronlari mitoxondrial transkripsiya faktori A genini (Tfam) maxsus ravishda yo'q qilishi natijasida kelib chiqqan mitoxondrial disfunktsiyaga ega dopamin neyronlarida (S6B-rasm) PCx ekspressiyasi ham sezilarli darajada oshgan (31), bu aseton kislotasi arteriosklerozi ekanligini ko'rsatadi. Kasallikning paydo bo'lishi organizmdagi neyronal OXPHOS disfunktsiyasi paytida tartibga solinadi. Shuni ta'kidlash kerakki, arterioskleroz bilan bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan neyronlarda ifodalanishi mumkin bo'lgan noyob fermentlar (32-34) OXPHOS yetishmaydigan PNlarda, masalan, propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), Malonil-CoA propionil-CoA ni suksinil-CoA ga aylantiradi va mitoxondrial olma fermenti 3 (ME3), uning asosiy roli piruvatni malatdan qaytarib olishdir (3-rasm, A va C) (33, 35). Bundan tashqari, biz Pdk3 fermentining sezilarli darajada oshganini aniqladik, u PDH ni fosforillaydi va shu bilan inaktiv qiladi (36), PDH ni faollashtiradigan Pdp1 fermentida yoki PDH ferment kompleksining o'zida hech qanday o'zgarish aniqlanmadi (3A-rasm). Mern2cKO PNlarida ketma-ket ravishda Ser293 dagi PDH kompleksining piruvat dehidrogenaza E1 komponentining α1 subbirligi α (PDHE1α) subbirligining fosforillanishi kuchaygan (PDH ferment faolligini inhibe qilishi ma'lum) (S6C-rasm) (S6C-rasm). Piruvatning tomirlarga kirish imkoniyati yo'q.
Nihoyat, biz serin va glitsin biosintezining super yo'li, tegishli mitoxondrial folat (1C) sikli va prolin biosintezi (1G-rasm va S5C-rasm) faollashuv jarayonida sezilarli darajada yuqori darajada tartibga solinganligini aniqladik. Atrofdagi to'qimalar mitoxondrial disfunktsiya bilan faollashadi (5-7). Ushbu proteomika ma'lumotlarini qo'llab-quvvatlovchi konfokal tahlil shuni ko'rsatdiki, OXPHOS yo'q bo'lgan PNda 8 haftalik sichqonlarning serebellar bo'laklari mitoxondrial folat siklining asosiy fermenti bo'lgan serin gidroksimetiltransferaza 2 (SHMT2) ga duchor qilingan. Muhim immun javob (S5D-rasm). 13 ta CU-glyukoza bilan inkubatsiya qilingan o'tkir serebellar bo'laklarida metabolik kuzatuv tajribalari serin va prolin biosintezining yuqori darajada tartibga solinishini yanada tasdiqladi, bu uglerod izoformlarining serin va prolinga oqimi oshganligini ko'rsatadi (S5E-rasm). GLS va GPT2 tomonidan qo'zg'atiladigan reaksiyalar glutamindan glutamat sintezi va glutamat va α-ketoglutarat o'rtasidagi transaminatsiya uchun javobgar bo'lganligi sababli, ularning yuqori regulyatsiyasi OXPHOS yetishmaydigan neyronlarning glutamatga bo'lgan talabi ortganligini ko'rsatadi. Bu prolinning biosintezining ortishini saqlab qolishga qaratilgan bo'lishi mumkin (S5C-rasm). Ushbu o'zgarishlardan farqli o'laroq, PNga xos Mfn2cKO sichqonlaridan olingan serebellar astrositlarning proteomik tahlili shuni ko'rsatdiki, bu yo'llar (shu jumladan, barcha antiperoksidazalar) ifodada sezilarli darajada o'zgarmagan, bu esa metabolik yo'naltirishning degradatsiyalangan PNga nisbatan tanlab ekanligini ko'rsatadi (S6-rasm, D dan G gacha).
Xulosa qilib aytganda, ushbu tahlillar PNlarda ma'lum metabolik yo'llarning vaqtinchalik faollashuvining sezilarli darajada farq qiladigan naqshlarini aniqladi. Neyronlarning mitoxondrial funktsiyasining g'ayritabiiyligi erta ateroskleroz va 1C remodelatsiyasiga (3E-rasm va S5C-rasm) va hatto I va IV komplekslarining ifodalanishidagi bashorat qilinadigan o'zgarishlarga olib kelishi mumkin bo'lsa-da, serine de novo sintezidagi o'zgarishlar faqat kech bosqichlarda aniqlandi. OXPHOS disfunktsiyasi (3E-rasm va S5C-rasm). Ushbu topilmalar stress keltirib chiqaradigan mitoxondrial (1C sikli) va sitoplazmatik (serin biosintezi) TCA siklidagi aterosklerozning oshishi bilan sinergik ravishda neyron metabolizmini qayta shakllantirish uchun javob beradigan ketma-ket jarayonni belgilaydi.
8 haftalik OXPHOS yetishmaydigan PNlar yuqori chastotali qo'zg'alish faolligini saqlab qolishi va mitoxondrial disfunktsiyani qoplash uchun sezilarli metabolik qayta ulanishni boshdan kechirishi mumkin. Ushbu kashfiyot, hatto shu paytda ham, bu hujayralar neyrodegeneratsiyani kechiktirish yoki oldini olish uchun terapevtik aralashuvni olishlari mumkinligi haqidagi qiziqarli imkoniyatni tug'diradi. Kech. Biz bu imkoniyatni ikkita mustaqil aralashuv orqali hal qildik. Birinchi usulda biz Cre-ga bog'liq adeno bilan bog'liq virus (AAV) vektorini yaratdik, shunda MFN2 in vivo sharoitida OXPHOS yetishmaydigan PNlarda tanlab ifodalanishi mumkin (S7A-rasm). MFN2 kodlovchi AAV va mCherry lyuminestsent reportyor geni (Mfn2-AAV) in vitro birlamchi neyron madaniyatlarida tekshirildi, bu esa MFN2 ning Cre-ga bog'liq tarzda ifodalanishiga olib keldi va mitoxondrial morfologiyani saqlab qoldi, shu bilan Mfn2cKO neyronlarida neyromutatsiyaning oldini oldi (S7, B, D va E-rasm). Keyin, biz 8 haftalik Mfn2-AAV ni Mfn2cKO va nazorat sichqonlarining serebellar korteksiga stereotaktik ravishda yetkazib berish uchun in vivo tajribalar o'tkazdik va 12 haftalik sichqonlarni tahlil qildik (4A-rasm). Davolangan Mfn2cKO sichqonlari nobud bo'ldi (1-rasm, A va B) (16). Virusli transduktsiya in vivo ba'zi serebellar doiralarida PN ning selektiv ifodalanishiga olib keldi (S7-rasm, G va H). Faqat mCherry (Ctrl-AAV) ni ifodalovchi nazorat AAV ning in'ektsiyasi Mfn2cKO hayvonlarida neyrodegeneratsiya darajasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. Aksincha, Mfn2-AAV bilan transduktsiyalangan Mfn2cKO larning tahlili PN hujayra qatlamining sezilarli himoya ta'sirini ko'rsatdi (4-rasm, B va C). Xususan, neyron zichligi nazorat hayvonlaridan deyarli farq qilmaydigan ko'rinadi (4-rasm, B va C va S7-rasm, H va I-rasm). MFN1 ning ifodalanishi, ammo MFN2 emas, neyronlar o'limini saqlab qolishda bir xil darajada samarali (4C-rasm va S7, C va F-rasmlar), bu ektopik MFN1 ning ifodalanishi MFN2 ning yo'qligini samarali ravishda to'ldirishi mumkinligini ko'rsatadi. Yagona PN darajasida keyingi tahlillar shuni ko'rsatdiki, Mfn2-AAV mitoxondriyalarning ultrastrukturasini asosan saqlab qoldi, mtDNK darajasini normallashtirdi va anti-angiogenez marker PCx ​​ning yuqori ifodasini qaytardi (4-rasm, C dan E gacha). Qutqarilgan Mfn2cKO sichqonlarini dam olish holatida vizual tekshirish ularning holati va harakat alomatlari (S1 dan S3 gacha harakat) yaxshilanganligini ko'rsatdi. Xulosa qilib aytganda, bu tajribalar shuni ko'rsatadiki, OXPHOSda jiddiy yetishmovchilik bo'lgan PNlarga MFN2 ni kechiktirilgan qayta kiritish mtDNK iste'molini qaytarib olish va aterosklerozni keltirib chiqarish uchun etarli, shu bilan akson degeneratsiyasi va neyronlar o'limini in vivo oldini oladi.
(A) Ko'rsatilgan metabolik yo'l faollashtirilganda MFN2 kodlovchi AAV in'ektsiyasining eksperimental jadvalini ko'rsatuvchi sxema. (B) Mfn2cKO sichqonlarida 8 haftada transduksiya qilingan va anti-Kalbindin antitelosi bilan belgilangan 12 haftalik serebellar bo'laklarining vakillik konfokal tasvirlari. O'ngda: Akson tolalarining masshtablanishi. Akson zumining masshtabi 450 va 75 mkm. (C) Chapda: AAV transduksiya halqasida (AAV+) Purkinje hujayra zichligini miqdorlash (dispersiyaning bir tomonlama tahlili; n = 3 sichqon). O'ngda: 12-haftada transduksiya qilingan PNda mtDNK fokus tahlili (juftlashtirilmagan t-test; uchta sichqondan n = 6 hujayra). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Ko'rsatilgan virusli vektorlar bilan transduksiya qilingan Mfn2cKO serebellar bo'laklarining PNlarining vakillik transmissiya elektron mikrografiyalari. Pushti niqob dendritlar egallagan maydonni, sariq nuqtali kvadrat esa o'ng tomonda berilgan zumni ko'rsatadi; n yadroni bildiradi. Masshtab chizig'i, 1 μm. (E) 12 haftada transduksiya qilingan PNda PCx bo'yash misolini ko'rsatadi. Masshtab chizig'i, 20 μm. OE, haddan tashqari ifoda; FC, burma o'zgarishi.
Nihoyat, biz OXPHOS disfunktsiyasini boshdan kechirgan PNlarda peroksidaza keltirib chiqaradigan hujayralarning omon qolishining ahamiyatini o'rganib chiqdik. Biz sichqoncha PCx mRNKsini (AAV-shPCx) maxsus nishonga olgan AAV-shRNK (qisqa sochli RNK) kodlovchi mCherry ni yaratdik va virusni yoki uning aralashtirilgan nazoratini (AAV-scr) Mfn2cKO sichqonlarining miyachasiga kiritdik. PCx ekspressiyasi oshgan (3C-rasm) va PN hujayra qatlami hali ham butun bo'lgan (1A-rasm) davrda samarali PCx nokdauniga erishish uchun in'ektsiya to'rtinchi haftalik yoshda (5A-rasm) amalga oshirildi. Shuni ta'kidlash kerakki, PCxni nokdaun qilish (S8A-rasm) PN o'limining sezilarli darajada tezlashishiga olib keladi, bu esa infektsiyalangan halqa bilan cheklangan (5, B va C-rasmlar). PCx ning yuqori regulyatsiyasi natijasida yuzaga keladigan metabolik ta'sir mexanizmini tushunish uchun biz glutationni baholash uchun PCx nokauti va AAV vositachiligidagi optik biosensor Grx1-roGFP2 bir vaqtning o'zida ifodalanganidan keyin PNlarning redoks holatini o'rgandik (S8-rasm, B dan D gacha). Keyin, FLIM shartlarini tekshirgandan so'ng sitoplazmatik redoks holatidagi potentsial o'zgarishlarni aniqlash uchun 7 haftalik Mfn2cKO yoki nazorat axlatdoshlarining o'tkir miya bo'laklarida ikki fotonli lyuminestsent umrbod tasvirlash mikroskopiyasi (FLIM) o'tkazdik (S8-rasm, E dan G gacha). Tahlil PCx ekspressiyasiga ega bo'lmagan bitta Mfn2cKO PNlarning oksidlanish holatida sezilarli darajada oshganligini ko'rsatdi, bu faqat aralashtirilgan shRNAni ifodalovchi nazorat neyronlari yoki Mfn2cKO PNlardan farq qiladi (5-rasm, D va E). PCx ekspressiyasi pastga qarab tartibga solinganida, yuqori darajada oksidlanish holatini ko'rsatuvchi Mfn2cKO PNlarning foizi uch martadan ko'proqqa oshdi (5E-rasm), bu PCxning yuqori regulyatsiyasi degeneratsiyalangan neyronlarning oksidlanish-qaytarilish qobiliyatini saqlab qolganligini ko'rsatadi.
(A) Ko'rsatilgan metabolik yo'l faollashtirilganda shPCx kodlovchi AAV in'ektsiyasining eksperimental jadvalini ko'rsatuvchi sxema. (B) 4 hafta davomida transduksiya qilingan va antikaltsinurin antitelosi bilan etiketlangan Mfn2cKO sichqonlarida 8 haftalik serebellar kesimlarining vakillik konfokal fotosuratlari. Masshtab satri, 450 μm. (C) AAV transduksiyalangan ilmoqlarda Purkinje hujayra zichligini miqdoriy aniqlash (dispersiyaning bir tomonlama tahlili; n = 3 dan 4 gacha sichqonlar). Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi; ***P<0.001. (D) Vakillik FLIM rasmida belgilangan eksperimental sharoitlarda glutation redoks sensori Grx1-roGFP2 ni ifodalovchi 7 haftalik PN ning o'rtacha umr ko'rish davomiyligi ko'rsatilgan. LUT (qidiruv jadvali) nisbati: omon qolish vaqti oralig'i (pikosekundlarda). Masshtab satri, 25 μm. (E) Gistogrammada (D) dan Grx1-roGFP2 umr ko'rish qiymatlarining taqsimlanishi ko'rsatilgan (har bir shart ostida ikkita sichqonchada n=158 dan 368 gacha hujayralar). Har bir gistogramma ustidagi doira diagrammasi: CTRL-AAV-scr da o'rtacha umr ko'rish qiymatining 1 SD dan oshib ketadigan, ancha uzunroq (qizil, oksidlangan) yoki qisqaroq (ko'k, kamaytirilgan) umr ko'rish qiymatlariga ega hujayralar soni ko'rsatilgan. (F) Taklif etilgan model neyronal PCx ning yuqori regulyatsiyasining himoya ta'sirini ko'rsatadi.
Umuman olganda, biz bu yerda taqdim etgan ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, MFN2 ning qayta ifodalanishi og'ir OXPHOS yetishmovchiligi, og'ir mtDNK kamayishi va o'ta g'ayritabiiy istaga o'xshash morfologiyaga ega bo'lgan rivojlangan PNni to'liq qutqarishi mumkin va shu bilan hatto rivojlangan kasalliklarda ham uzluksiz rivojlanishni ta'minlaydi. Neyrodegeneratsiya hujayra o'limidan oldingi bosqichning qaytariladigan dalillarini taqdim etadi. Metabolik moslashuvchanlikning bu darajasi neyronlarning aterosklerozni (TCA siklining qayta ulanishi) qo'zg'atish qobiliyati bilan yanada ta'kidlanadi, bu OXPHOSga ega bo'lmagan PNlarda PCx ifodasini inhibe qiladi va hujayra o'limini kuchaytiradi, shu bilan himoya rolini o'ynaydi (5F-rasm).
Ushbu tadqiqotda biz PNlarning OXPHOS disfunktsiyasiga javobi metabolik dasturlar tomonidan faollashtirilgan differentsial faollashuv yo'li orqali asta-sekin TCA siklidagi aterosklerozga yaqinlashishiga oid dalillarni taqdim etdik. Biz proteomik tahlilni ko'plab qo'shimcha usullar bilan tasdiqladik va og'ir mitoxondrial disfunktsiya bilan bog'liq muammolarga duch kelganda, neyronlar ilgari noma'lum bo'lgan metabolik elastiklik shakliga ega ekanligini aniqladik. Bizni ajablantiradigan narsa shundaki, butun qayta ulash jarayoni neyrodegeneratsiya bilan asta-sekin va qaytarilmas tarzda birga keladigan terminal metabolik holatni belgilamaydi, ammo bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, u hujayra o'limidan oldingi bosqichda ham qo'llab-quvvatlovchi neyronni tashkil qilishi mumkin. Funksional kompensatsiya mexanizmi. Bu topilma neyronlar organizmda sezilarli darajada metabolik plastiklikka ega ekanligini ko'rsatadi. Bu fakt MFN2 ning keyinchalik qayta kiritilishi asosiy metabolik markerlarning ifodasini o'zgartirishi va PN degeneratsiyasining oldini olishi mumkinligini isbotlaydi. Aksincha, u aterosklerozni inhibe qiladi va nervlarni tezlashtiradi. transseksual.
Tadqiqotimizdagi eng qiziqarli topilmalardan biri shundaki, OXPHOSga ega bo'lmagan PNlar arteriosklerozni rag'batlantiruvchi fermentlarni kuchaytirish orqali TCA sikli metabolizmini o'zgartirishi mumkin. Metabolik qayta tashkil etish saraton hujayralarining keng tarqalgan xususiyati bo'lib, ularning ba'zilari nafas olish zanjirini boshqaradigan va lipid va nukleotid biosintezi prekursorlarini ishlab chiqarishni ta'minlaydigan reduktor ekvivalentlarini ishlab chiqarish uchun TCA sikli oraliq mahsulotlarini to'ldirish uchun glutaminga tayanadi (39, 40). Yaqinda o'tkazilgan tadqiqot shuni ko'rsatdiki, OXPHOS disfunktsiyasini boshdan kechirayotgan periferik to'qimalarda glutamin/glutamat metabolizmining qayta ulanishi ham muhim xususiyatdir (5, 41), bu yerda glutaminning TCA sikliga kirish yo'nalishi OXPHOS shikastlanishining og'irligiga bog'liq (41). Biroq, organizmdagi neyronal metabolik plastiklikning har qanday o'xshashligi va uning kasallik kontekstidagi mumkin bo'lgan ahamiyati haqida aniq dalillar yo'q. Yaqinda o'tkazilgan in vitro tadqiqotda birlamchi kortikal neyronlar glutamat hovuzlarini neyrotransmissiya uchun safarbar qilishi va shu bilan metabolik stress sharoitida oksidlovchi metabolizm va aterosklerozni kuchaytirishi ko'rsatildi (42). Shuni ta'kidlash kerakki, TCA sikli fermenti suksinat dehidrogenazaning farmakologik inhibatsiyasi ostida piruvat karboksillanishi kulturalangan serebellar granula neyronlarida oksaloatsetat sintezini saqlab qoladi deb ishoniladi (34). Biroq, bu mexanizmlarning miya to'qimalariga fiziologik ahamiyati (bu yerda ateroskleroz asosan astrositlar bilan chegaralangan deb ishoniladi) hali ham muhim fiziologik ahamiyatga ega (43). Bu holda, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, organizmda OXPHOS tomonidan shikastlangan PNlar TCA pulining oraliq mahsulotlarini to'ldirishning ikkita asosiy manbai bo'lgan BCAA degradatsiyasi va piruvat karboksillanishiga o'tishi mumkin. BCAA katabolizmining neyron energiya metabolizmiga qo'shgan taxminiy hissasi, glutamat va GABA ning neyrotransmissiya uchun rolidan tashqari (44), ammo bu mexanizmlar uchun in vivo dalillar hali ham mavjud emas. Shuning uchun, disfunktsional PNlar aterosklerozni kuchaytirish orqali assimilyatsiya jarayoni tomonidan boshqariladigan TCA oraliq mahsulotlarini iste'mol qilishni avtomatik ravishda qoplashi mumkin deb taxmin qilish oson. Xususan, aspartik kislotaga bo'lgan talabning ortib borishini saqlab qolish uchun PCx ning yuqori regulyatsiyasi talab qilinishi mumkin, bu mitoxondrial disfunktsiyali proliferatsiyalanuvchi hujayralarda tavsiya etiladi (45). Biroq, bizning metabolomika tahlilimiz Mfn2cKO PNlarida aspartik kislotaning barqaror holatdagi darajasida sezilarli o'zgarishlarni aniqlamadi (S6A-rasm), bu proliferatsiyalanuvchi hujayralar va postmitotik neyronlar o'rtasida aspartik kislotaning metabolik ishlatilishining turlicha ekanligini aks ettiradi. In vivo sharoitida disfunktsional neyronlarda PCx ning yuqori regulyatsiyasining aniq mexanizmi tavsiflanishi kerak bo'lsa-da, biz bu erta javob neyronlarning oksidlanish-qaytarilish holatini saqlab qolishda muhim rol o'ynashini ko'rsatdik, bu esa serebellar bo'laklarida FLIM tajribalarida ko'rsatilgan. Xususan, PN larning PCx ni yuqori regulyatsiyasining oldini olish oksidlanish holatini kuchaytirishi va hujayra o'limini tezlashtirishi mumkin. BCAA degradatsiyasining faollashishi va piruvatning karboksillanishi mitoxondrial disfunktsiyaning periferik to'qimalarini tavsiflash usullari emas (7). Shuning uchun, ular OXPHOS yetishmaydigan neyronlarning ustuvor xususiyati bo'lib tuyuladi, hatto yagona xususiyat bo'lmasa ham, bu neyrodegeneratsiya uchun muhimdir.
Serebellar kasalligi odatda ataksiya sifatida namoyon bo'ladigan va ko'pincha PNlarga zarar yetkazadigan heterojen neyrodegenerativ kasallik turidir (46). Bu neyron populyatsiyasi mitoxondrial disfunktsiyaga ayniqsa moyil, chunki sichqonlardagi ularning selektiv degeneratsiyasi inson spinocerebellar ataksiyasini tavsiflovchi ko'plab motor alomatlarini qayta tiklash uchun etarli (16, 47, 48). Xabarlarga ko'ra, mutant geni bo'lgan transgen sichqon modeli inson spinocerebellar ataksiyasi bilan bog'liq va mitoxondrial disfunktsiyaga ega (49, 50), bu PNPHda OXPHOS yetishmovchiligining oqibatlarini o'rganish muhimligini ta'kidlaydi. Shuning uchun, bu noyob neyron populyatsiyasini samarali ravishda ajratib olish va o'rganish ayniqsa mos keladi. Biroq, PNlar bosimga juda sezgir va butun serebellar hujayra populyatsiyasining past qismini tashkil etishi hisobga olinsa, ko'plab omikaga asoslangan tadqiqotlar uchun ularni butun hujayralar sifatida selektiv ajratish hali ham qiyin jihat hisoblanadi. Boshqa hujayra turlarining (ayniqsa, kattalar to'qimalarining) ifloslanishining mutlaq yo'qligiga erishish deyarli imkonsiz bo'lsa-da, biz proteomika tahlili uchun yetarli miqdordagi hayotiy neyronlarni olish uchun samarali dissotsiatsiya bosqichini FACS bilan birlashtirdik va butun serebellumning mavjud ma'lumotlar to'plamiga nisbatan ancha yuqori oqsil qoplamasiga (taxminan 3000 ta oqsil) ega bo'ldik (51). Butun hujayralarning hayotiyligini saqlab qolish orqali biz bu yerda taqdim etayotgan usul nafaqat mitoxondriyalardagi metabolik yo'llardagi o'zgarishlarni tekshirishga, balki uning sitoplazmatik analoglaridagi o'zgarishlarni ham tekshirishga imkon beradi, bu esa hujayra turini boyitish uchun mitoxondrial membrana teglaridan foydalanishni to'ldiradi. Murakkab to'qimalarda mitoxondriyalar soni uchun yangi usul (52, 53). Biz tasvirlab bergan usul nafaqat Purkinje hujayralarini o'rganish bilan bog'liq, balki mitoxondrial disfunktsiyaning boshqa modellarini o'z ichiga olgan kasal miyalardagi metabolik o'zgarishlarni hal qilish uchun har qanday turdagi hujayraga osongina qo'llanilishi mumkin.
Nihoyat, biz ushbu metabolik qayta tashkil etish jarayonida hujayra stressining asosiy belgilarini butunlay o'zgartira oladigan va neyron degeneratsiyasining oldini oladigan terapevtik oynani aniqladik. Shuning uchun, bu yerda tasvirlangan qayta simlashning funktsional oqibatlarini tushunish mitoxondrial disfunktsiya paytida neyronlarning hayotiyligini saqlab qolish uchun mumkin bo'lgan davolash usullari haqida fundamental tushunchalar berishi mumkin. Ushbu tamoyilning boshqa nevrologik kasalliklarga qo'llanilishini to'liq ochib berish uchun boshqa miya hujayralari turlarida energiya almashinuvidagi o'zgarishlarni tahlil qilishga qaratilgan kelajakdagi tadqiqotlar zarur.
MitoPark sichqonlari ilgari tasvirlangan (31). LoxP yonboshlovchi Mfn2 genlariga ega C57BL/6N sichqonlari ilgari tasvirlangan (18) va L7-Cre sichqonlari bilan chatishtirilgan (23). Olingan qo'shaloq heterozigota avlod keyin gomozigota Mfn2loxP/Mfn2loxP sichqonlari bilan chatishtirilib, Mfn2 uchun Purkinjega xos gen nokautlari (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) hosil qilindi. Juftlashuvning bir qismiga Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alleli (stop-mtYFP) qo'shimcha chatishtirishlar orqali kiritildi (20). Barcha hayvonlar protseduralari Yevropa, milliy va institutsional ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi va Shimoliy Reyn-Vestfaliya, Germaniyaning Umwelt va Verbraucherschutz shaharlaridan LandesamtfürNatur tomonidan tasdiqlandi. Hayvonlar bilan ishlash, shuningdek, Yevropa Laboratoriya Hayvonlari Fanlari Assotsiatsiyalari Federatsiyasi ko'rsatmalariga amal qiladi.
Homilador ayolning bachadon bo'yni chiqishi anesteziya qilingandan so'ng, sichqoncha embrioni ajratiladi (E13). Korteks 10 mM Hepes qo'shilgan Hanks muvozanatli tuz eritmasida (HBSS) ajratildi va papain (20 U/ml) va sistein (1 mkg/ml) o'z ichiga olgan Dulbecco'ning Modified Eagle's muhitiga o'tkazildi. To'qimalarni DMEMda inkubatsiya qiling va fermentativ hazm qilish orqali ajrating. Ml) 37°C da 20 daqiqa davomida, so'ngra 10% homila sigir zardobi qo'shilgan DMEMda mexanik ravishda maydalang. Hujayralar tasvirlash tahlili uchun polilizin bilan qoplangan shisha qopqoqlarga 6 sm madaniyat idishida 2 × 106 zichlikda yoki 0,5 × 105 hujayra/sm2 zichlikda ekildi. 4 soatdan so'ng, muhit 1% B27 qo'shimchasi va 0,5 mM GlutaMax o'z ichiga olgan Neurobasal zardobsiz muhit bilan almashtirildi. Keyin neyronlar tajriba davomida 37°C va 5% CO2 da saqlandi va haftada bir marta oziqlantirildi. In vitro sharoitida rekombinatsiyani qo'zg'atish uchun in vitro sharoitida ikkinchi kuni neyronlarni davolash uchun quyidagi AAV9 virus vektorining 3 mkl (24 quduqli madaniyat idishi) yoki 0,5 mkl (24 quduqli plastinka) ishlatilgan: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalog raqami 105530-AAV9) va AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalog raqami 105545-AAV9).
Sichqoncha Mfn1 va Mfn2 komplementar DNKsi (mos ravishda Addgene plazmidasi #23212 va #23213 dan olingan) C-terminalida V5 ketma-ketligi (GKPIPNPLLGLDST) bilan belgilanadi va T2A ketma-ketligi orqali ramkada mCherry bilan birlashtiriladi. Grx1-roGFP2 Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) dan sovg'adir. tdTomato kassetasini an'anaviy klonlash usullari yordamida almashtirish orqali kasseta pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 va pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorlarini yaratish uchun pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorlariga subklonlashtirildi. Shunga o'xshash strategiya pAAV-CAG-FLEX-mCherry boshqaruv vektorini yaratish uchun ishlatilgan. AAV-shPCx konstruktsiyasini yaratish uchun plazmid AAV vektori (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) talab qilinadi, u sichqoncha PCx ni nishonga oluvchi shRNA ni kodlovchi DNK ketma-ketligini o'z ichiga oladi (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 promouteri nazorati ostida mCherry CMV promouteri nazorati ostida ishlatiladi. Yordamchi AAV vektorlarini ishlab chiqarish ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi (Cell Biolabs). Qisqasi, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ni tashuvchi transfer plazmididan foydalaning, 293AAV hujayralari-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) yoki Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodlovchi genini, shuningdek, AAV1 kapsid oqsili va qo'shimcha oqsilni kodlang. Plazmid plazmidini qadoqlash, kaltsiy fosfat usuli yordamida. Xom virus supernatanti quruq muz/etanol vannasida muzlatish-eritish sikllari va fosfat buferli sho'r suvda (PBS) lizislangan hujayralar orqali olingan. AAV vektori uzluksiz yodixanol gradientli ultrasantrifugalash orqali tozalandi (32000 rpm va 4°C da 24 soat) va Amicon ultra-15 santrifüj filtri yordamida konsentratsiyalandi. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genom nusxasi (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX genom titri avval tasvirlanganidek (54), real vaqt miqdoriy PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) va AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) yordamida o'lchandi.
Birlamchi neyronlar muzdek 1x PBSda qirib olindi, granulalarga aylantirildi va keyin fosfataza va proteaza inhibitori (Roche) ni o'z ichiga olgan 0,5% Triton X-100 / 0,5% natriy deoksixolat/PBS lizis buferida gomogenlashtirildi. Oqsil miqdori bisinxonin kislotasi tahlili (Thermo Fisher Scientific) yordamida amalga oshirildi. Keyin oqsillar SDS-poliakrilamid gel elektroforezi yordamida ajratildi va keyin poliviniliden ftorid membranasiga (GE Healthcare) surtildi. Nospesifik joylarni bloklang va birlamchi antikor (batafsil ma'lumot uchun S1 jadvaliga qarang) bilan 5% sutda TBST (Tween bilan Tris-buferlangan sho'r suv), yuvish bosqichlarida va TBST Incubate da ikkilamchi antikor bilan inkubatsiya qiling. Birlamchi antikor bilan +4°C da bir kechada inkubatsiya qiling. Yuvgandan so'ng, ikkilamchi antikorni xona haroratida 2 soat davomida qo'llang. Keyinchalik, xuddi shu blotni anti-β-aktin antikori bilan inkubatsiya qilish orqali bir xil yuklama tasdiqlandi. Ximiluminestsentsiyaga o'tish va ximiluminestsentsiyani kuchaytirish orqali aniqlash (GE Healthcare).
Ilgari shisha qoplamalarga ekilgan neyronlar belgilangan vaqt nuqtasida xona haroratida 10 daqiqa davomida 4% paraformaldegid (PFA)/PBS bilan fiksatsiya qilindi. Qopqoqlarga avval xona haroratida 5 daqiqa davomida 0,1% Triton X-100/PBS, so'ngra bloklovchi buferda [3% sigir zardobidagi albumin (BSA)/PBS] suziladi. Ikkinchi kuni qoplamalar bloklovchi bufer bilan yuvildi va xona haroratida 2 soat davomida tegishli fluorofor bilan konjuge qilingan ikkilamchi antitelo bilan inkubatsiya qilindi; nihoyat, namunalar PBSda 4′,6-diamidino-2-Fenilindol (DAPI) bilan qayta bo'yalgan holda yaxshilab yuvildi va keyin Aqua-Poly/Mount yordamida mikroskop slaydiga fiksatsiya qilindi.
Sichqonlarga (erkak va urg'ochi) ketamin (130 mg/kg) va ksilazin (10 mg/kg) qorin bo'shlig'iga in'ektsiya qilish orqali behushlik qilindi va teri ostiga karprofen og'riq qoldiruvchi vosita (5 mg/kg) yuborildi. Va iliq prokladka bilan jihozlangan stereotaktik asbobga (Kopf) joylashtirildi. Bosh suyagini oching va stomatologik burg'u yordamida serebellar korteksining mis suyagiga mos keladigan qismini yupqalashtiring (lambdadan: dum 1.8, lateral 1, IV va V bo'laklariga mos keladi). Quyidagi qon tomir tizimini buzmaslik uchun bosh suyagida ehtiyotkorlik bilan kichik teshik hosil qilish uchun egri shprits ignasidan foydalaning. Keyin ingichka tortilgan shisha kapillyar asta-sekin mikro-teshikka kiritiladi (dura materning ventral tomonida -1.3 dan -1 gacha) va 200 dan 300 nl gacha AAV qo'lda shpritslar (Narishige) bilan mikro-injektorga (Narishige) past bosim ostida bir necha marta 10 dan 20 daqiqagacha bo'lgan vaqt oralig'ida yuboriladi. Infuziyadan so'ng, virus to'liq tarqalishi uchun kapillyarni yana 10 daqiqaga joylashtiring. Kapillyarlar olib tashlangandan so'ng, yara yallig'lanishini minimallashtirish va hayvonning sog'ayib ketishi uchun teri ehtiyotkorlik bilan tikiladi. Operatsiyadan keyin bir necha kun davomida hayvonlarga og'riq qoldiruvchi vositalar (kaspofen) berildi, bu vaqt ichida ularning jismoniy holati diqqat bilan kuzatildi va keyin belgilangan vaqtda evtanaziya qilindi. Barcha protseduralar Yevropa, milliy va institutsional ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi va Germaniyaning Shimoliy Reyn-Vestfaliya shtatidagi Umwelt va Verbraucherschutz shahridagi LandesamtfürNatur tomonidan tasdiqlandi.
Hayvonlarga ketamin (100 mg/kg) va ksilazin (10 mg/kg) bilan anesteziya qilindi va yurak avval 0,1 M PBS, keyin esa PBSda 4% PFA bilan perfuz qilindi. To'qima ajratildi va 4°C da bir kecha davomida 4% PFA/PBSda fiksatsiya qilindi. PBSda fiksatsiyalangan miyadan sagittal kesimlarni (qalinligi 50 mkm) tayyorlash uchun tebranuvchi pichoq (Leica Microsystems GmbH, Vena, Avstriya) ishlatilgan. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, erkin suzuvchi kesimlarni bo'yash yuqorida (13) xona haroratida tasvirlanganidek va aralashtirib amalga oshirildi. Xulosa qilib aytganda, avval olingan bo'laklar xona haroratida 15 daqiqa davomida 0,5% Triton X-100/PBS bilan o'tkazildi; ba'zi epitoplar (Pcx va Shmt2) uchun 80°C (PH 9) da tris-EDTA buferida bo'laklarni bu bosqich o'rniga 25 daqiqa qizdiring. Keyin, kesmalar birlamchi antitelo (S1-jadvalga qarang) bilan bloklovchi buferda (3% BSA/PBS) 4°C haroratda bir kecha davomida aralashtirib inkubatsiya qilindi. Ertasi kuni kesmalar bloklovchi bufer bilan yuvildi va xona haroratida 2 soat davomida tegishli fluorofor bilan konjuge qilingan ikkilamchi antitelo bilan inkubatsiya qilindi; nihoyat, kesmalar PBSda yaxshilab yuvildi, DAPI bilan bo'yaldi va keyin mikroskop slaydida AquaPolymount bilan fiksatsiya qilindi.
Namunani tasvirlash uchun oq yorug'lik lazeri va 405 diodli ultrabinafsha lazer bilan jihozlangan lazerli skanerlovchi konfokal mikroskop (TCS SP8-X yoki TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ishlatilgan. Fluoroforni qo'zg'atish va signalni gibrid detektor (HyDs) bilan to'plash orqali LAS-X dasturi ketma-ket rejimda Nyquist namunalariga mos keladigan ustma-ust qo'yilgan tasvirlarni to'plash uchun ishlatilgan: miqdoriy bo'lmagan panellar uchun bu juda dinamik signallar (masalan, somatik hujayralar va dendritlarda) mtYFP) BrightR rejimida PNlar sonini aniqlash uchun HyD dan foydalaning. Fonni kamaytirish uchun 0,3 dan 6 ns gacha bo'lgan darvozalash qo'llaniladi.
Saralangan hujayralarni real vaqt rejimida tasvirlash. 1% B27 qo'shimchasi va 0,5 mM GlutaMax o'z ichiga olgan Neurobasal-A muhitida saralangandan so'ng, hujayralar darhol poli-l-lizin bilan qoplangan shisha slaydlarga (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalog raqami 80826) ekildi. Keyin hujayralar cho'kishi uchun uni 37°C va 5% CO2 da 1 soat davomida ushlab turing. Real vaqt rejimida tasvirlash oq lazer, HyD, 63×[1,4 raqamli diafragma (NA)] moyli obyektiv linzasi va isitish bosqichi bilan jihozlangan Leica SP8 lazerli skanerlash konfokal mikroskopida amalga oshirildi.
Sichqoncha tezda karbonat angidrid bilan behushlik qilindi va boshi kesildi, miya tezda bosh suyagidan chiqarildi va 200 mkm qalinlikdagi (13C yorliqlash tajribasi uchun) yoki 275 mkm qalinlikdagi (ikki foton tajribasi uchun) sagittal kesimga kesildi, quyidagi materiallar bilan to'ldirildi. Muzqaymoq (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germaniya) quyidagi moddalar bilan to'ldirilgan: 125 mM muzdek, uglerod bilan to'yingan (95% O2 va 5% CO2) kam Ca2 + sun'iy orqa miya suyuqligi (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriy fosfat buferi, 25 mM NaHCO3, 25 mM glyukoza, 0,5 mM CaCl2 va 3,5 mM MgCl2 (osmotik bosim 310 dan 330 mmol gacha). Olingan miya bo'laklarini yuqori Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriy fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glyukoza, 1.0 mM CaCl2 va 2.0 mM MgCl2) o'rtacha (pH 7.4 va 310 dan 320 mmol gacha) bo'lgan inkubatsiyadan oldingi kameraga o'tkazing.
Tasvirlash jarayonida bo'laklar maxsus tasvirlash xonasiga ko'chirildi va tajriba 32° dan 33°C gacha bo'lgan doimiy haroratda uzluksiz ACSF perfuziyasi ostida o'tkazildi. Bo'laklarni tasvirlash uchun Leica 25x obyektiv linzasi (NA 0.95, suv), Ti: Sapphire lazeri (Chameleon Vision II, Coherent) bilan jihozlangan ko'p fotonli lazerli skanerlash mikroskopi (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ishlatilgan. FLIM moduli (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 ning FLIMi. PNlarning sitoplazmatik oksidlanish-qaytarilish holatidagi o'zgarishlar sagittal miya bo'laklarida ikki fotonli FLIM yordamida o'lchandi, bu yerda Grx1-roGFP2 biosensori PNlarni nishonga oldi. PN qatlamida, hayotiy PN (ya'ni, dendritlar bo'ylab munchoqsimon tuzilish yoki neyron morfologik o'zgarishlarning yo'qligi) va shRNA PCx yoki uning boshqaruv ketma-ketligini (har biri mCherry ni birgalikda ifodalovchi) kodlovchi ikki musbat roGFP2 sensori va AAV mavjudligini ta'minlash uchun olish maydoni kesma yuzasidan taxminan 50 dan 80 mkm gacha tanlanadi. 2x raqamli kattalashtirish [qo'zg'alish to'lqin uzunligi: 890 nm; 512 nm 512 piksel] bilan bitta qatlamli tasvirlarni to'plang va egri chiziqni moslashtirish uchun yetarli fotonlar (jami 1000 foton) to'planishini ta'minlash uchun 2-3 daqiqa ichida o'rtacha tasvir ishlatiladi. Grx1-roGFP2 zondining sezgirligi va FLIM sharoitlarini tekshirish perfuziya ACSFga ekzogen 10 mM H2O2 qo'shilganda roGFP2 ning umr ko'rish davomiyligini kuzatish (oksidlanishni maksimal darajada oshirish, natijada umr ko'rish davomiyligi oshadi) va keyin 2 mM ditiotreitol qo'shish (qaytarilish darajasini minimallashtiradi, natijada umr ko'rish davomiyligi pasayadi) orqali amalga oshirildi (S8-rasm, D dan G gacha). Olingan natijalarni tahlil qilish uchun FLIMfit 5.1.1 dasturidan foydalaning, butun tasvirning bitta eksponensial parchalanish egri chizig'ini o'lchangan IRF (asbobning javob funksiyasi) ga moslang va χ2 taxminan 1 ga teng. Bitta PN ning umr ko'rish davomiyligini hisoblash uchun asab tanasi atrofidagi niqob qo'lda chizilgan va har bir niqobdagi o'rtacha umr ko'rish miqdorini aniqlash uchun ishlatilgan.
Mitoxondrial potensial tahlili. O'tkir kesma perfuziyalangan ACSFga to'g'ridan-to'g'ri qo'shilgan 100 nM TMRM bilan 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, PNlarning mitoxondrial potensial o'zgarishlari ikki fotonli mikroskop yordamida o'lchandi. TMRM tasvirlash zondni 920 nm da qo'zg'atish va signallarni to'plash uchun ichki HyD (tetrametilrodamin izotiyosiyanat: 585/40 nm) yordamida amalga oshirildi; bir xil qo'zg'alish to'lqin uzunligidan foydalanib, lekin mtYFP tasvirini olish uchun boshqa ichki HyD (FITC:525/50) yordamida. Bitta hujayra darajasida mitoxondrial potensialni baholash uchun ImageJ ning Image Calculator plaginidan foydalaning. Qisqasi, plagin tenglamasi: signal = min (mtYFP, TMRM) mos keladigan kanalning bitta stack konfokal tasvirida Purkinje Somali TMRM signalini ko'rsatadigan mitoxondrial mintaqani aniqlash uchun ishlatiladi. Keyin hosil bo'lgan niqobdagi piksel maydoni miqdori aniqlanadi va keyin mitoxondrial potensialni ko'rsatuvchi mitoxondrial fraksiyani olish uchun mtYFP kanalining mos keladigan chegaraviy bitta qatlamli tasvirida normallashtiriladi.
Tasvir Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) dasturi yordamida chigallashtirildi. Plitkalarning skanerlangan rasmlari uchun bitta plitkaning montaji LAS-X dasturi tomonidan taqdim etilgan avtomatik tikish algoritmi yordamida amalga oshiriladi. Tasvirni kalibrlashdan so'ng, tasvirni yanada qayta ishlash va yorqinlik va kontrastni bir xilda sozlash uchun ImageJ va Adobe Photoshopdan foydalaning. Grafik tayyorlash uchun Adobe Illustratordan foydalaning.
mtDNK fokus tahlili. mtDNK lezyonlari soni konfokal mikroskop yordamida DNKga qarshi antikorlar bilan belgilangan serebellar kesimlarda aniqlandi. Har bir nishon maydoni hujayra tanasi va har bir hujayraning yadrosi uchun yaratildi va tegishli maydon Multi Measure plagini (ImageJ dasturi) yordamida hisoblab chiqildi. Sitoplazmatik maydonni olish uchun hujayra tanasi maydonidan yadro maydonini ayiring. Nihoyat, Analyze Particles plagini (ImageJ dasturi) pol tasvirida mtDNKni ko'rsatuvchi sitoplazmatik DNK nuqtalarini avtomatik ravishda aniqlash uchun ishlatildi va olingan natijalar CTRL sichqonlarining PN o'rtacha qiymatiga normallashtirildi. Natijalar har bir hujayradagi nukleozidlarning o'rtacha soni sifatida ifodalanadi.
Oqsil ekspressiyasi tahlili. PNdagi oqsil ekspressiyasini bitta hujayra darajasida baholash uchun ImageJ ning Image Calculator plaginidan foydalaning. Qisqasi, mos keladigan kanalning bir qavatli konfokal tasvirida, signal = min (mtYFP, antikor) tenglama orqali Purkinada ma'lum bir antikorga immunoreaktivlikni ko'rsatadigan mitoxondrial mintaqa aniqlanadi. Keyin hosil bo'lgan niqobdagi piksel maydoni miqdori aniqlanadi va keyin ko'rsatilgan oqsilning mitoxondrial fraksiyasini olish uchun mtYFP kanalining mos keladigan chegaraviy bitta qatlamli tasvirida normallashtiriladi.
Purkinje hujayralari zichligini tahlil qilish. ImageJ ning hujayra hisoblagichi plagini Purkinje zichligini baholash uchun hisoblangan Purkinje hujayralari sonini hisoblangan hujayralar egallagan serebellar halqasining uzunligiga bo'lish orqali ishlatilgan.
Namuna tayyorlash va yig'ish. Nazorat guruhi va Mfn2cKO sichqonlarining miyalari 0,1 M fosfat buferida (PB) 2% PFA/2,5% glutaraldegidda fiksatsiya qilindi, so'ngra koronal kesmalar kipriklar (Leica Mikrosysteme GmbH, Vena, Avstriya) yordamida tayyorlandi (qalinligi 50 dan 60 mkm gacha). Keyin xona haroratida 1% os tetraoksid va 1,5% kaliy ferrosiyanidda PB buferida 1 soat davomida fiksatsiya qilindi. Kesimlar uch marta distillangan suv bilan yuvildi va keyin 20 daqiqa davomida 1% uranil asetat o'z ichiga olgan 70% etanol bilan bo'yaldi. Keyin kesimlar navlangan spirtda suvsizlantirildi va kremniy bilan qoplangan shisha slaydlar orasiga Durcupan ACM (Araldite quyma qatroni M) epoksi qatroni (Elektron Mikroskopiya Fanlar, katalog raqami 14040) solindi va nihoyat 60°C da pechda 48 soat davomida polimerizatsiya qilindi. Miyacha po'stlog'i maydoni tanlandi va Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vena, Avstriya) da 50 nm o'ta yupqa kesmalar kesildi va polistirol plyonka bilan qoplangan 2×1 mm mis kesma panjarada tanlandi. Kesmalarga 10 daqiqa davomida 4% uranil asetatning H2Odagi eritmasi bilan bo'yaldi, bir necha marta H2O bilan yuvildi, so'ngra 10 daqiqa davomida H2Odagi Reynolds qo'rg'oshin sitrati bilan yuvildi va keyin bir necha marta H2O bilan yuvildi. Mikrograflar Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) transmissiya elektron mikroskopi yordamida TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 raqamli kamerasi (TVIPS GmbH, Gauting, AQSh) yordamida olindi.
AAV bilan kasallangan sichqonlar uchun miya ajratilib, 1 mm qalinlikdagi sagittal kesimga kesildi va AAV bilan kasallangan halqani (ya'ni mCherry ifodasini) aniqlash uchun serebellum lyuminestsent mikroskop yordamida tekshirildi. Faqat AAV in'ektsiyasi kamida ikkita ketma-ket serebellar halqasida Purkinje hujayra qatlamining (ya'ni deyarli butun qatlamning) juda yuqori transduktsiya samaradorligiga olib keladigan tajribalar qo'llaniladi. AAV bilan o'tkazilgan halqa fiksatsiyadan keyingi kecha uchun mikrodissektsiya qilindi (0,1 M kokoat buferida 4% PFA va 2,5% glutaraldegid) va keyinchalik qayta ishlandi. EPON joylashtirish uchun fiksatsiyalangan to'qima 0,1 M natriy kokoat buferi (Applichem) bilan yuvildi va 0,1 M natriy kokoat buferida (Applichem) 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) bilan 4 soat inkubatsiya qilindi, so'ngra 2 soat davomida yuvildi. 0,1 M kokamid buferi bilan 3 marta takrorlang. Keyinchalik, to'qimalarni suvsizlantirish uchun har bir etanol eritmasini 4°C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilish uchun etanolning ko'tariluvchi qatori ishlatildi. To'qima propilen oksidiga o'tkazildi va EPON (Sigma-Aldrich) da 4°C da bir kechada inkubatsiya qilindi. To'qimani xona haroratida 2 soat davomida yangi EPONga joylashtiring va keyin uni 62°C da 72 soat davomida joylashtiring. Ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) va olmosli pichoq (Diatome, Biel, Shveytsariya) yordamida 70 nm ultra yupqa kesimlarni kesib oling va 37°C da 15 daqiqa davomida 1,5% uranil asetat bilan bo'yang va 4 daqiqa davomida qo'rg'oshin sitrat eritmasi bilan bo'yang. Elektron mikrograflar Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) va DigitalMicrograph dasturi (Gatan) bilan jihozlangan JEM-2100 Plus uzatish elektron mikroskopi (JEOL) yordamida olindi. Tahlil qilish uchun elektron mikrograflar 5000 × yoki 10 000 × raqamli zum bilan olingan.
Mitoxondriyallarning morfologik tahlili. Barcha tahlillar uchun alohida mitoxondriyallarning konturlari ImageJ dasturi yordamida raqamli tasvirlarda qo'lda chizilgan. Turli morfologik parametrlar tahlil qilingan. Mitoxondriyal zichlik har bir hujayraning umumiy mitoxondriyal maydonini sitoplazma maydoniga (sitoplazma maydoni = hujayra maydoni-hujayra yadrosi maydoni) × 100 ga bo'lish orqali olingan foiz sifatida ifodalanadi. Mitoxondriyallarning yumaloqligi [4π∙(maydon/perimetr 2)] formulasi bilan hisoblanadi. Mitoxondriyallarning ista morfologiyasi tahlil qilindi va ularning asosiy shakllariga ko'ra ikki toifaga ("naychali" va "pufakcha") bo'lindi.
Avtofagosoma/lizosoma soni va zichlik tahlili. Raqamli tasvirda har bir avtofagosoma/lizosomaning konturlarini qo'lda belgilash uchun ImageJ dasturidan foydalaning. Avtofagosoma/lizosoma maydoni har bir hujayraning umumiy avtofagosoma/lizosoma struktura maydonini sitoplazma maydoniga bo'lish yo'li bilan hisoblangan foiz sifatida ifodalanadi (sitoplazma maydoni=hujayra maydoni-yadro maydoni)×100. Avtofagosomalar/lizosomalarning zichligi umumiy sonni har bir hujayradagi avtofagosoma/lizosoma strukturalari soniga bo'lish yo'li bilan hisoblanadi (sitoplazmatik maydon bo'yicha) (sitoplazmatik maydon = hujayra maydoni-yadro maydoni).
O'tkir kesish va namunalarni tayyorlash uchun yorliqlash. Glyukoza yorlig'ini talab qiladigan tajribalar uchun o'tkir miya bo'laklarini to'yingan uglerod (95% O2 va 5% CO2), yuqori Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriy fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glyukoza, 1.0 mM CaCl2 va 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 ga sozlangan va 310 dan 320 mOsm gacha) bo'lgan inkubatsiyadan oldingi kameraga o'tkazing, bunda glyukoza 13C6- Glyukoza o'rnini bosadi (Eurisotop, katalog raqami CLM-1396). Piruvat bilan etiketlashni talab qiladigan tajribalar uchun o'tkir miya bo'laklarini yuqori Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriy fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glyukoza, 1.0 mM CaCl2) ga o'tkazing va 2.0 mM MgCl2 qo'shing, pH 7.4 ga sozlang va 310 dan 320 mOsm gacha) va 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, katalog raqami CLM-1082) qo'shing. Kesishlarni 37°C da 90 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Tajriba oxirida kesmalar tezda 75 mM ammoniy karbonat o'z ichiga olgan suvli eritma (pH 7.4) bilan yuvildi va keyin 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: suvda gomogenlashtirildi. Kesimlar muz ustida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng, namunalar 21000 g da 10 daqiqa davomida 4°C da santrifuga qilindi va tiniq supernatant SpeedVac konsentratorida quritildi. Olingan quritilgan metabolit granulasi tahlil qilinmaguncha -80°C da saqlandi.
13 ta C-yorliqli aminokislotalarning suyuq xromatografiya-massa spektrometriyasi tahlili. Suyuq xromatografiya-massa spektrometriyasi (LC-MS) tahlili uchun metabolit granulasi 75 mkl LC-MS sinfidagi suvda (Honeywell) qayta eritilgan. 21000 g da 4°C da 5 daqiqa davomida santrifüjlangandan so'ng, aminokislota oqimini tahlil qilish uchun 20 mkl tozalangan supernatant ishlatilgan, qolgan ekstrakt esa darhol anion tahlili uchun ishlatilgan (quyida qarang). Aminokislota tahlili avval tasvirlangan benzoil xlorid hosilalarini aniqlash protokoli yordamida amalga oshirildi (55, 56). Birinchi bosqichda 20 mkl metabolit ekstraktiga 10 mkl 100 mM natriy karbonat (Sigma-Aldrich) qo'shildi, so'ngra LC sinfidagi ACNga 10 mkl 2% benzoil xlorid (Sigma-Aldrich) qo'shildi. Namuna qisqa vaqt ichida vorteks qilindi va keyin 21000 g da 20°C da 5 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Tozalangan supernatantni konussimon shisha qo'shimchali (200 mkl hajm) 2 ml avtosampler flakoniga o'tkazing. Namunalar Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) yuqori aniqlikdagi aniqlikdagi massa spektrometriga (Thermo Fisher Scientific) ulangan Acquity iClass ultra yuqori samarali LC tizimi (Waters) yordamida tahlil qilindi. Tahlil qilish uchun olingan namunaning 2 mkl qismi 1,8 mkm zarrachalarni o'z ichiga olgan 100 × 1,0 mm yuqori kuchli silika T3 ustuniga (Waters) yuborildi. Oqim tezligi 100 mkl/min ni tashkil qiladi va bufer tizimi A buferidan (10 mM ammoniy format va suvda 0,15% chumoli kislotasi) va B buferidan (ACN) iborat. Gradient quyidagicha: 0 daqiqada 0%B; 0%B. 0 dan 0,1 daqiqagacha 0 dan 15% gacha B; 0,1 dan 0,5 daqiqagacha 15 dan 17% gacha B; 0,5 dan 14 daqiqagacha 17 dan 55% gacha B; 14 dan 14,5 daqiqagacha 55 dan 70% gacha B; 18 daqiqada 14,5 dan 70 gacha 100% gacha B; 18 dan 19 daqiqagacha 100% gacha B; 19 dan 19,1 daqiqagacha 100 dan 0% gacha B; 19,1 dan 28 daqiqagacha 0% B (55, 56). QE-HF massa spektrometri musbat ionlanish rejimida m/z (massa/zaryad nisbati) massa diapazoni 50 dan 750 gacha bo'lgan holda ishlaydi. Qo'llaniladigan aniqlik 60 000 ga teng, olingan kuchaytirishni boshqarish (AGC) ion nishoni 3 × 106 ga teng va maksimal ion vaqti 100 millisekundga teng. Isitilgan elektropurkagich ionlanish (ESI) manbai 3,5 kV purkash kuchlanishida, 250°C kapillyar haroratda, 60 AU (ixtiyoriy birliklar) qobiq havo oqimida va 20 AU 250°C yordamchi havo oqimida ishlaydi. S linzasi 60 AU ga o'rnatilgan.
13C yorliqli organik kislotalarning anion xromatografiyasi-MS tahlili. Qolgan metabolit cho'kmasi (55 mkl) QE-HF mass-spektrometriga (Thermo Fisher Scientific) ulangan Dionex ion xromatografiya tizimi (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) yordamida tahlil qilindi. Qisqasi, 5 mkl metabolit ekstrakti HPLC (2 mm × 250 mm, zarracha hajmi 4 mkm, Thermo Fisher Scientific) bilan jihozlangan Dionex IonPac AS11-HC ustuniga 1 to'ldirish nisbati bilan qisman halqa rejimida yuborildi.) Dionex IonPac AG11-HC himoya ustuni (2 mm x 50 mm, 4 mkm, Thermo Fisher Scientific). Ustun harorati 30°C da saqlanadi va avtosampler 6°C ga o'rnatiladi. Eluent generatori orqali kaliy gidroksid gradientini hosil qilish uchun deionlangan suv bilan ta'minlangan kaliy gidroksid kartrijidan foydalaning. Metabolitlarni 380 mkl/min oqim tezligida ajratish, quyidagi gradientni qo'llash: 0 dan 3 daqiqagacha, 10 mM KOH; 3 dan 12 daqiqagacha, 10 dan 50 mM KOH; 12 dan 19 daqiqagacha, 50 dan 100 mM KOH; 19 dan 21 daqiqagacha, 100 mM KOH; 21 dan 21,5 daqiqagacha, 100 dan 10 mM KOH. Ustun 10 mM KOH ostida 8,5 daqiqa davomida qayta muvozanatlashtirildi.
Elyutsiyalangan metabolitlar ustundan keyin 150 mkl/min izopropanol qo'shimcha oqimi bilan birlashtiriladi va keyin salbiy ionlanish rejimida ishlaydigan yuqori aniqlikdagi mass-spektrometrga yo'naltiriladi. MS massa diapazonini m/z 50 dan 750 gacha, 60 000 aniqlikda kuzatmoqda. AGC 1 × 106 ga o'rnatilgan va maksimal ion vaqti 100 ms da saqlanadi. Isitilgan ESI manbai 3,5 kV purkash kuchlanishida ishladi. Ion manbaining boshqa sozlamalari quyidagicha: kapillyar harorati 275°C; qobiq gaz oqimi, 60 AU; yordamchi gaz oqimi, 300°C da 20 AU va S linzasi sozlamalari 60 AU ga o'rnatiladi.
13C yorliqli metabolitlarning ma'lumotlar tahlili. Izotop nisbati ma'lumotlarini tahlil qilish uchun TraceFinder dasturidan (4.2 versiyasi, Thermo Fisher Scientific) foydalaning. Har bir birikmaning o'ziga xosligi ishonchli ma'lumotnoma birikmasi bilan tekshirildi va mustaqil ravishda tahlil qilindi. Izotoplarni boyitish tahlilini o'tkazish uchun har bir 13C izotopining (Mn) ajratib olingan ion xromatogrammasi (XIC) maydoni [M + H]+ dan ajratib olindi, bu yerda n - aminokislotalarni tahlil qilish uchun ishlatiladigan maqsadli birikmaning uglerod soni yoki [MH]+ anionlarni tahlil qilish uchun ishlatiladi. XIC ning massa aniqligi millionga besh qismdan kam va RT ning aniqligi 0,05 daqiqa. Boyitish tahlili har bir aniqlangan izotopning mos keladigan birikmaning barcha izotoplari yig'indisiga nisbatini hisoblash orqali amalga oshiriladi. Bu nisbatlar har bir izotop uchun foiz qiymatlari sifatida beriladi va natijalar avvalroq (42) tasvirlanganidek, molyar foiz boyitish (MPE) sifatida ifodalanadi.
Muzlatilgan neyron granulasi muzdek 80% metanolda (v/v) gomogenlashtirildi, vortekslandi va -20°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Namuna yana vortekslandi va +4°C da 30 daqiqa davomida aralashtirildi. Namuna 21000 g da 4°C da 5 daqiqa davomida santrifuga qilindi, so'ngra hosil bo'lgan supernatant yig'ilib, keyingi tahlil uchun 25°C da SpeedVac konsentratori yordamida quritildi. Yuqorida tavsiflanganidek, saralangan hujayralarning aminokislotalarida LC-MS tahlili o'tkazildi. TraceFinder (4.2 versiyasi, Thermo Fisher Scientific) yordamida har bir birikmaning monoizotopik massasi yordamida ma'lumotlar tahlili o'tkazildi. Metabolit ma'lumotlarining kvantil normalizatsiyasi preprocessCore dasturiy ta'minot paketi (57) yordamida amalga oshirildi.
Kesilgan bo'laklarni tayyorlash. Sichqoncha tezda karbonat angidrid bilan behushlik qilindi va boshi kesildi, miya tezda bosh suyagidan chiqarildi va muz bilan to'ldirilgan tebranuvchi pichoq (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germaniya) yordamida uni 300 dan 375 mkm gacha sagittal kesimlarga kesib tashlash mumkin. Sovuq uglerod gazifikatsiyasi (95% O2 va 5% CO2) Kam Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriy fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glyukoza, 1.0 mM CaCl2 va 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 ga va 310 dan 330 mOsm gacha sozlang). Olingan miya bo'laklarini yuqoriroq Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriy fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glyukoza, 4.0 mM CaCl2 va mM 3.5 MgCl2) pH qiymati 7.4 va 310 dan 320 mOsm gacha bo'lgan kameraga o'tkazing. Bo'laklarni yozib olishdan oldin ularni tiklash mumkin bo'lishi uchun 20-30 daqiqa davomida saqlang.
yozib olish. Barcha yozuvlar uchun o'rnatilgan yozib olish kamerasi va 20x suvga botirish obyektiv linzasi (Scientifica) bilan jihozlangan mikroskop pog'onasi ishlatilgan. Taxminiy Purkinje hujayralari (i) tana hajmi, (ii) serebellumning anatomik joylashuvi va (iii) lyuminestsent mtYFP reporter genining ifodalanishi bo'yicha aniqlangan. Uchining qarshiligi 5 dan 11 megohmgacha bo'lgan yamoqli pipetka borosilikat shisha kapillyar (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germaniya) va gorizontal pipetka Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA tomonidan tortib olinadi. Barcha yozuvlar Signal dasturiy ta'minoti (6.0 versiyasi, Cambridge Electronic, Cambridge, Buyuk Britaniya) tomonidan boshqariladigan ELC-03XS npi yamoqli qisqich kuchaytirgichi (npi electronic GmbH, Tam, Germaniya) tomonidan amalga oshirildi. Tajriba 12,5 kHz namuna olish tezligida qayd etildi. Signal mos ravishda 1,3 va 10 kHz kesish chastotalariga ega ikkita qisqa o'tkazuvchan Bessel filtrlari bilan filtrlanadi. Membrana va pipetkaning sig'imi kuchaytirgich yordamida kompensatsiya sxemasi bilan kompensatsiyalanadi. Barcha tajribalar Hokawo dasturiy ta'minoti (2.8 versiyasi, Hamamatsu, Gerden, Germaniya) tomonidan boshqariladigan Orca-Flash 4.0 kamerasi (Hamamatsu, Gerden, Germaniya) boshqaruvi ostida o'tkazildi.
Muntazam butun hujayra konfiguratsiyasi va tahlili. Yozib olishdan oldin darhol pipetkani quyidagi moddalarni o'z ichiga olgan ichki eritma bilan to'ldiring: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliy glyukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanozin trifosfat (GTP) (Na) va 10,0 mM kreatinin fosfat pH 7,25 ga sozlandi va osmotik bosim 290 mOsm (saxaroza) ni tashkil etdi. Membranani yorish uchun 0 pA kuch qo'llanilgandan so'ng darhol tinch membrana potensiali o'lchandi. Kirish qarshiligi -40, -30, -20 va -10 pA giperpolyarizatsiyalangan toklarni qo'llash orqali o'lchanadi. Kuchlanish javobining kattaligini o'lchang va kirish qarshiligini hisoblash uchun Om qonunidan foydalaning. Spontan faollik kuchlanish qisqichida 5 daqiqa davomida qayd etildi va sPSC yarim avtomatik aniqlash skripti yordamida Igor Pro (32 7.01 versiyasi, WaveMetrics, Leyk Oswego, Oregon, AQSh) da aniqlandi va o'lchandi. IV egri chizig'i va barqaror holatdagi tok batareyani turli potensiallarda (-110 mV dan boshlab) siqish va kuchlanishni 5 mV bosqichlarda oshirish orqali o'lchanadi. AP ishlab chiqarilishi depolyarizatsiya tokini qo'llash orqali sinovdan o'tkazildi. Depolyarizatsiya tok impulsini qo'llash paytida katakchani -70 mV da siqib chiqaring. Har bir yozuv birligining qadam o'lchamini alohida sozlang (10 dan 60 pA gacha). Eng yuqori AP chastotasini keltirib chiqaradigan impuls tikanlarini qo'lda sanab, maksimal AP chastotasini hisoblang. AP chegarasi bir yoki bir nechta APlarni birinchi bo'lib ishga tushiradigan depolyarizatsiya impulsining ikkinchi hosilasi yordamida tahlil qilinadi.
Teshilgan yamoq konfiguratsiyasi va tahlili. Standart protokollar yordamida teshilgan yamoq yozuvini bajaring. Quyidagi tarkibiy qismlarni o'z ichiga olmaydigan ATP va GTPsiz pipetkadan foydalaning: 128 mM glyukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA va 2 mM MgCl2 va pH 7.2 ga sozlang (KOH yordamida). Hujayra membranasining nazoratsiz o'tkazuvchanligini oldini olish uchun ATP va GTP hujayra ichidagi eritmadan chiqarib tashlanadi. Yamoq pipetkasi teshilgan yamoq yozuvini olish uchun amfoteritsin o'z ichiga olgan ichki eritma (taxminan 200 dan 250 mkg/ml gacha; G4888, Sigma-Aldrich) bilan to'ldiriladi. Amfoteritsin dimetil sulfoksidda eritildi (yakuniy konsentratsiya: 0.1 dan 0.3 gacha; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Qo'llanilgan DMSO konsentratsiyasi o'rganilayotgan neyronlarga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. Teshiklash jarayonida kanal qarshiligi (Ra) doimiy ravishda kuzatildi va Ra va AP amplitudasi barqarorlashgandan so'ng (20-40 daqiqa) tajriba boshlandi. Spontan faollik kuchlanish va/yoki tok qisqichida 2 dan 5 daqiqagacha o'lchanadi. Ma'lumotlar tahlili Igor Pro (7.05.2 versiyasi, WaveMetrics, AQSh), Excel (2010 versiyasi, Microsoft Corporation, Redmond, AQSh) va GraphPad Prism (8.1.2 versiyasi, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) yordamida amalga oshirildi. Spontan APlarni aniqlash uchun IgorPro ning NeuroMatic v3.0c plaginidan foydalaniladi. APlarni avtomatik ravishda har bir yozuv uchun alohida sozlanadigan berilgan chegara yordamida aniqlang. Tiklanish oralig'idan foydalanib, maksimal oniy tiklanish chastotasi va o'rtacha tiklanish chastotasi bilan tiklanish chastotasini aniqlang.
PN izolyatsiyasi. Avval nashr etilgan protokolga moslashish orqali PNlar sichqoncha serebellumidan ma'lum bir bosqichda tozalandi (58). Qisqasi, serebellum muzdek dissotsiatsiya muhitida [HBSS Ca2+ va Mg2+siz, 20 mM glyukoza, penitsillin (50 U/ml) va streptomitsin (0,05 mg/ml) bilan to'ldirilgan] ajratildi va maydalandi, so'ngra muhit papainda hazm qilindi [HBSS, 1-sistein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) va deoksiribonukleaza I (DNase I; 0,1 mg/ml) bilan to'ldirilgan] 30°C da 30 daqiqa davomida davolang. Avval to'qimalarni tuxum shilimshiqligi (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) va DNase (0,1 mg/ml) ni o'z ichiga olgan HBSS muhitida xona haroratida fermentativ hazm bo'lishining oldini olish uchun yuving, so'ngra 20 mM glyukoza saqlovchi HBSS muhitida HBSS, penitsillin (50 U/ml), streptomitsin (0,05 mg/ml) va DNase (0,1 mg/ml) da muloyimlik bilan maydalab, bitta hujayralarni chiqarib yuboring. Olingan hujayra suspenziyasi 70 mkm hujayra suzgichidan filtrlandi, so'ngra hujayralar santrifugalash (1110 rpm, 5 daqiqa, 4°C) orqali granulalarga aylantirildi va saralash muhitida [HBSS, 20 mM glyukoza, 20% homila sigirlari) zardobi, penitsillin (50 U/ml) va streptomitsin (0,05 mg/ml) bilan to'ldirildi] qayta suspenziya qilindi; propidium yodidi bilan hujayralarning hayotiyligini baholang va hujayra zichligini 1 × 106 dan 2 × 106 hujayra/ml gacha sozlang. Oqim sitometriyasidan oldin, suspenziya 50 mkm hujayra süzgeci orqali filtrlandi.
Oqim sitometri. Hujayralarni saralash 4°C da FACSAria III apparati (BD Biosciences) va FACSDiva dasturi (BD Biosciences, 8.0.1 versiyasi) yordamida amalga oshirildi. Hujayra suspenziyasi 100 mkm naycha yordamida 20 psi bosim ostida ~2800 hodisa/sek tezlikda saralandi. An'anaviy darvozalash mezonlari (hujayra hajmi, bimodal farqlash va sochilish xususiyatlari) PN ni boshqa hujayra turlaridan to'g'ri ajratishni ta'minlay olmasligi sababli, darvozalash strategiyasi mitoYFP+ ​​​​va nazorat mitoYFP − sichqonlarida YFP intensivligi va avtofloresansni to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash asosida o'rnatiladi. YFP namunani 488 nm lazer chizig'i bilan nurlantirish orqali qo'zg'atiladi va signal 530/30 nm diapazonli o'tkazgich filtri yordamida aniqlanadi. mitoYFP+ ​​sichqonlarida Rosa26-mitoYFP reporter genining nisbiy kuchi neyron tanasi va akson parchalarini ajratish uchun ham ishlatiladi. 7-AAD 561 nm sariq lazer bilan qo'zg'atiladi va o'lik hujayralarni chiqarib tashlash uchun 675/20 nm o'tkazuvchanlik filtri bilan aniqlanadi. Astrositlarni bir vaqtning o'zida ajratish uchun hujayra suspenziyasi ACSA-2-APC bilan bo'yalgan, so'ngra namuna 640 nm lazer chizig'i bilan nurlantirilgan va signalni aniqlash uchun 660/20 nm o'tkazuvchanlik filtri ishlatilgan.
Yig'ilgan hujayralar santrifugatsiya (1110 rpm, 5 daqiqa, 4°C) orqali granulalarga aylantirildi va ishlatilgunga qadar -80°C da saqlandi. Mfn2cKO sichqonlari va ularning axlat kuchuklari protsedura o'zgaruvchanligini minimallashtirish uchun bir kunda tasniflanadi. FACS ma'lumotlarini taqdim etish va tahlil qilish FlowJo dasturi (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, AQSh) yordamida amalga oshirildi.
Yuqorida aytib o'tilganidek (59), real vaqt rejimidagi PCR keyingi mtDNK miqdorini aniqlash uchun saralangan neyronlardan DNKni ajratish uchun ishlatiladi. Chiziqlilik va chegara sezgirligi dastlab turli sonli hujayralarda qPCRni ishga tushirish orqali sinovdan o'tkazildi. Qisqasi, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 va proteinaza K (200 ng/ml) dan iborat lizis buferida 300 ta PN to'plang va 55°C da 120 daqiqa inkubatsiya qiling. Proteinaza K ning to'liq inaktivatsiyasini ta'minlash uchun hujayralar 95°C da 10 daqiqa davomida qo'shimcha inkubatsiya qilindi. mt-Nd1 ga xos TaqMan zondidan (Thermo Fisher) foydalanib, mtDNK 7900HT real vaqt rejimidagi PCR tizimida (Thermo Fisher Scientific) yarim miqdoriy PCR orqali o'lchandi. Science, katalog raqami Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalog raqami AIVI3E8) va 18S (Thermo Fisher Scientific, katalog raqami Hs99999901_s1) genlari.
Proteom namunasini tayyorlash. Eritmani 95°C da 10 daqiqa davomida qizdirish va sonikatsiya qilish orqali lizis buferida [6 M guanidin xlorid, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin gidroxlorid, 10 mM xloroatsetamid va 100 mM tris- HCl da muzlatilgan neyron granulalarini lizis qiling]. Bioruptor (Diagenode) da 10 daqiqa davomida (30 soniya puls / 30 soniya pauza davri). Namuna 20 mM tris-HCl (pH 8.0) da 1:10 nisbatda suyultirildi, 300 ng tripsin oltin (Promega) bilan aralashtirildi va to'liq hazm bo'lish uchun 37°C da bir kechada inkubatsiya qilindi. Ikkinchi kuni namuna 20 000 g da 20 daqiqa davomida santrifuga qilindi. Supernatant 0,1% chumoli kislotasi bilan suyultirildi va eritma o'z-o'zidan tayyorlangan StageTips bilan tuzsizlantirildi. Namuna SpeedVac asbobida (Eppendorf konsentratori plyus 5305) 45°C da quritildi, so'ngra peptid 0,1% chumoli kislotasida suspenziya qilindi. Barcha namunalar bir vaqtning o'zida bir kishi tomonidan tayyorlandi. Astrosit namunalarini tahlil qilish uchun 4 mkg tuzsizlantirilgan peptidlar tandem massa yorlig'i (TMT10plex, katalog raqami 90110, Thermo Fisher Scientific) bilan peptidning TMT reaktiviga nisbati 1:20 bo'lgan holda etiketlandi. TMT yorlig'i uchun 0,8 mg TMT reaktivi 70 mkl suvsiz ACNda qayta suspenziya qilindi va quritilgan peptid 9 mkl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat) ga qayta tiklandi, unga ACNdagi 7 mkl TMT reaktivi qo'shildi. Konsentratsiya 43,75% ni tashkil etdi. 60 daqiqa inkubatsiyadan so'ng, reaksiya 2 μl 5% gidroksilamin bilan so'ndi. Belgilangan peptidlar yig'ildi, quritildi, 200 μl 0,1% chumoli kislotasida (FA) qayta eritib, ikkiga bo'lindi va keyin o'z-o'zidan tayyorlangan StageTips yordamida tuzsizlantirildi. UltiMate 3000 ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografi (UltiMate 3000 ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografi) yordamida ikki yarmidan biri 130Å1,7μm C18 zarralari bilan to'ldirilgan 1 mm x 150 mm Acquity xromatografik ustunida fraktsiyalandi (Waters, katalog raqami SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptidlarni 30 mkl/min oqim tezligida ajrating, 1% dan 50% gacha bo'lgan bufer B dan 85 daqiqa davomida 96 daqiqa bosqichma-bosqich gradiyent bilan ajrating, 50% dan 95% gacha bo'lgan bufer B dan 3 daqiqa davomida, keyin 95% bufer B uchun 8 daqiqa davomida ajrating; A buferi 5% ACN va 10 mM ammoniy bikarbonat (ABC) dan, B buferi esa 80% ACN va 10 mM ABC dan iborat. Har 3 daqiqada fraksiyalarni to'plang va ularni ikki guruhga (1 + 17, 2 + 18 va boshqalar) birlashtiring va vakuumli santrifugada quriting.
LC-MS/MS tahlili. Mass-spektrometriya uchun peptidlar (r119.aq raqami) 1,9 mkm ReproSil-Pur 120 C18-AQ muhiti (Dr. Maisch, mat) bilan jihozlangan 25 sm, 75 mkm ichki diametrli PicoFrit analitik ustunida (yangi obyektiv linzasi, qism raqami PF7508250) ajratildi, Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germaniya). Ustun 50°C da saqlandi. A va B buferlari mos ravishda suvda 0,1% chumoli kislotasi va 80% ACNda 0,1% chumoli kislotasi. Peptidlar 6% dan 31% gacha B buferidan 65 daqiqa davomida va 31% dan 50% gacha B buferidan 5 daqiqa davomida 200 nl/min gradient bilan ajratildi. Elyutsiyalangan peptidlar Orbitrap Fusion mass-spektrometrida (Thermo Fisher Scientific) tahlil qilindi. Peptid prekursorining m/z o'lchami 350 dan 1500 m/z gacha bo'lgan diapazonda 120 000 aniqlikda amalga oshirildi. 27% normallashtirilgan to'qnashuv energiyasidan foydalanib, yuqori energiyali C tuzoq dissotsiatsiyasi (HCD) bo'linishi uchun 2 dan 6 gacha zaryad holatiga ega eng kuchli prekursor tanlandi. Sikl vaqti 1 s ga o'rnatildi. Peptid fragmentining m/z qiymati ion tuzog'ida eng kichik AGC nishoni 5 × 104 va maksimal in'ektsiya vaqti 86 ms yordamida o'lchandi. Parchalanishdan so'ng, prekursor 45 s davomida dinamik chiqarib tashlash ro'yxatiga kiritildi. TMT bilan belgilangan peptidlar 50 sm, 75 mkm Acclaim PepMap ustunida (Thermo Fisher Scientific, katalog raqami 164942) ajratildi va migratsiya spektrlari yuqori maydonli assimetrik to'lqin shaklidagi ionlar (FAIMS) uskunasi (Thermo Fisher Scientific) bilan jihozlangan Orbitrap Lumos Tribrid mass-spektrometrida (Thermo Fisher Scientific) tahlil qilindi, u −50 va −70 V ikkita kompensatsiya kuchlanishida ishlaydi. Sinxronizatsiya prekursoriga asoslangan MS3 TMT hisoboti ion signalini o'lchash uchun ishlatiladi. Peptidlarni ajratish EASY-nLC 1200 da, 90% chiziqli gradientli elyutsiyasi yordamida, bufer konsentratsiyasi 6% dan 31% gacha bo'lgan holda amalga oshirildi; A buferi 0,1% FA va B buferi 0,1% FA va 80% ACN edi. Analitik ustun 50°C da ishlaydi. Asl faylni FAIMS kompensatsiya kuchlanishiga muvofiq ajratish uchun FreeStyle (1.6 versiyasi, Thermo Fisher Scientific) dan foydalaning.
Oqsilni aniqlash va miqdorini aniqlash. Integratsiyalashgan Andromeda qidiruv tizimidan foydalanib, asl ma'lumotlar MaxQuant 1.5.2.8 versiyasi (https://maxquant.org/) yordamida tahlil qilindi. Aequorea victoria dan olingan Cre rekombinaza va YFP ketma-ketliklariga qo'shimcha ravishda, sichqoncha mos yozuvlar proteomining (Proteome ID UP000000589, UniProt dan 2017-yil may oyida yuklab olingan) kanonik ketma-ketligi va izoform ketma-ketligi uchun peptid fragment spektrlari qidirildi. Metionin oksidlanishi va oqsil N-terminal atsetilatsiyasi o'zgaruvchan modifikatsiyalar sifatida o'rnatildi; sistein karbamoil metilatsiyasi belgilangan modifikatsiyalar sifatida o'rnatildi. Ovqat hazm qilish parametrlari "o'ziga xoslik" va "tripsin/P" ga o'rnatildi. Oqsilni aniqlash uchun ishlatiladigan peptidlar va ustara peptidlarining minimal soni 1 ga teng; noyob peptidlarning minimal soni 0 ga teng. Peptid xaritasini moslashtirish shartlari ostida oqsilni aniqlash darajasi 0,01 ga teng edi. "Ikkinchi peptid" opsiyasi yoqilgan. Muvaffaqiyatli identifikatsiyalarni turli xil asl fayllar o'rtasida o'tkazish uchun "ishlar orasidagi moslik" opsiyasidan foydalaning. Yorliqsiz miqdoriy aniqlash (LFQ) uchun LFQ minimal nisbat soni 1 dan foydalaning (60). LFQ intensivligi har bir vaqt nuqtasida kamida bitta genotip guruhida kamida ikkita haqiqiy qiymat uchun filtrlanadi va kengligi 0,3 va pastga siljigan normal taqsimotdan ekstrapolyatsiya qilinadi. LFQ natijalarini tahlil qilish uchun Perseus hisoblash platformasidan (https://maxquant.net/perseus/) va R (https://r-project.org/) foydalaning. Differentsial ifoda tahlili uchun limma dasturiy ta'minot paketidan ikki tomonlama o'rtacha t testi ishlatilgan (61). Tadqiqot ma'lumotlari tahlili ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally va pheatmap yordamida amalga oshiriladi. TMT asosidagi proteomika ma'lumotlari MaxQuant 1.6.10.43 versiyasi yordamida tahlil qilindi. UniProtning 2018-yil sentabr oyida yuklab olingan inson proteomikasi ma'lumotlar bazasidan xom proteomika ma'lumotlarini qidiring. Tahlil ishlab chiqaruvchi tomonidan taqdim etilgan izotop tozaligini tuzatish koeffitsientini o'z ichiga oladi. Differentsial ifoda tahlili uchun R da limma dan foydalaning. Asl ma'lumotlar, ma'lumotlar bazasini qidirish natijalari va ma'lumotlarni tahlil qilish ish jarayoni va natijalarining barchasi PRIDE hamkor ombori orqali ProteomeXchange alyansida PXD019690 ma'lumotlar to'plami identifikatori bilan saqlanadi.
Funksional annotatsiyalar tahlilni boyitadi. 8 haftalik ma'lumotlar to'plamining funktsional annotatsiya shartlarining boyligini aniqlash uchun Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) vositasidan foydalanildi (1-rasm). Qisqasi, LC-MS/MS (tandem mass-spektrometriyasi) ma'lumotlar tahlilidan olingan miqdoriy oqsillar ro'yxati quyidagi filtr mezonlari bilan qo'llaniladi: Mus musculus tur va fon sifatida tanlanadi va kategoriya Benjaminini tomonidan 0,05 yoki undan pastroq boyitish uchun sozlangan P qiymatini ko'rsatadi, bu muhim deb hisoblanadi. Ushbu grafik uchun har bir klasterdagi sozlangan P qiymatiga asoslangan eng yaxshi beshta ortiqcha kategoriya ko'rsatilgan. Benjaminini, Krieger va Yekutieli (Q = 5%) ning ikki bosqichli chiziqli kuchaytirish dasturidan foydalangan holda, bir nechta t-testdan foydalanib, har bir kategoriyada aniqlangan muhim nomzodlar bo'yicha vaqt kursi oqsili ekspressiyasi tahlili o'tkaziladi va har bir qator alohida tahlil qilinadi. Izchil SDni qo'llashga hojat yo'q.
Ushbu tadqiqot natijalarini nashr etilgan ma'lumotlar bazalari bilan taqqoslash va 1-rasmda Venn diagrammasini yaratish uchun biz miqdoriy oqsillar ro'yxatini MitoCarta 2.0 annotatsiyalari (24) bilan birlashtirdik. Diagrammani yaratish uchun Draw Venn Diagram onlayn vositasidan (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) foydalaning.
Proteomika tahlili uchun qo'llaniladigan statistik protseduralar haqida batafsil ma'lumot olish uchun, iltimos, Materiallar va usullar bo'limiga qarang. Boshqa barcha tajribalar uchun batafsil ma'lumotni tegishli afsonada topish mumkin. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, barcha ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi va barcha statistik tahlillar GraphPad Prism 8.1.2 dasturi yordamida amalga oshirildi.
Ushbu maqola uchun qo'shimcha materiallar uchun http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ga qarang.
Bu Creative Commons Attribution-Notijorat Litsenziyasi shartlari asosida tarqatiladigan ochiq kirish maqolasi bo'lib, u har qanday vositada foydalanish, tarqatish va ko'paytirishga imkon beradi, agar oxirgi foydalanish tijorat maqsadlarida foydalanilmasa va asl asar to'g'ri bo'lsa.
Eslatma: Sizdan faqat elektron pochta manzilingizni taqdim etishingizni so'raymiz, shunda sahifaga tavsiya qilgan odam siz elektron pochtani ko'rishini xohlayotganingizni va u spam emasligini biladi. Biz hech qanday elektron pochta manzillarini yozib olmaymiz.
Bu savol sizning tashrif buyuruvchi ekanligingizni tekshirish va avtomatik spam yuborishning oldini olish uchun ishlatiladi.
E. Motori, I. Atanasov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisko, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Disfunktsional neyronlarning proteomik tahlili shuni ko'rsatdiki, metabolik dasturlar neyrodegeneratsiyaga qarshi turish uchun faollashadi.
E. Motori, I. Atanasov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisko, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Disfunktsional neyronlarning proteomik tahlili shuni ko'rsatdiki, metabolik dasturlar neyrodegeneratsiyaga qarshi turish uchun faollashadi.
©2020 Amerika fan taraqqiyoti assotsiatsiyasi. barcha huquqlar himoyalangan. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef va COUNTER hamkori hisoblanadi. Science Advances ISSN 2375-2548.