Hozirgi manzil: OX11 0DE, Buyuk Britaniya, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Buyuk Britaniya, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektron biologik tasvirlash markazi.
Reaksiya markazining yorug'lik yig'uvchi kompleksi 1 (RC-LH1) binafsha fototrof bakteriyalarning asosiy fotosintetik komponentidir. Biz Rhodopseudomonas palustrisdan olingan RC-LH1 kompleksining ikkita krio-elektron mikroskopiya tuzilmasini kiritdik. RC-LH114-W kompleksining 2.65-Å o'lchamdagi tuzilishi RC ni o'rab turgan 14 ta LH1 kichik birligidan iborat bo'lib, u W oqsili bilan uziladi, oqsil-W bo'lmagan kompleks esa butunlay RC tarkibi bilan o'ralgan. Yopiq 16 ta LH1 kichik birligi. Ushbu tuzilmalarni taqqoslash RC-LH1 kompleksidagi xinon dinamikasi, jumladan, RC QB joyida xinon bilan bog'langanda ilgari aniqlanmagan konformatsion o'zgarishlar, shuningdek, ularni RC ga o'tkazishga yordam beradigan yordamchi xinon bog'lanish joylarining joylashuvi haqida tushuncha beradi. W oqsilining noyob tuzilishi LH1 halqasining yopilishiga to'sqinlik qiladi va shu bilan xinon/xinolon almashinuvini tezlashtirish uchun kanal yaratadi.
Fotosintez tomonidan ta'minlanadigan energiya Yer yuzidagi deyarli barcha hayotni ta'minlay oladi va quyosh biotexnologiyasi uchun katta salohiyatga ega. Binafsha fototrof bakteriyalar global fotosintezni rivojlantirish bilan birga, turli xil energiya rejimlari va metabolik qobiliyatlarni ham namoyish etadi. Ular fotosintezdan qochishi va qorong'ida heterotrof bakteriyalar sifatida o'sishi, azot va karbonat angidridni fiksatsiya qilishi, vodorod ishlab chiqarishi va aromatik birikmalarni parchalashi mumkin (1-3). Bu jarayonlar uchun energiya ta'minlash uchun yorug'lik tez va samarali ravishda kimyoviy energiyaga aylanishi kerak. Bu jarayon yorug'likni ushlovchi antenna kompleksi yorug'likni yutib, ushlangan energiyani reaksiya markaziga (RC) o'tkazganda boshlanadi va shu bilan zaryadni ajratish boshlanadi (4-7). Binafsha fototrof bakteriyalarda fotosintezning asosiy birligi yorug'likni yig'uvchi 1-kompleks (LH1) bilan o'ralgan 2-turdagi RC dan iborat bo'lib, RC-LH1 yadro kompleksini hosil qiladi. LH1 egri αβ geterodimerlar massividan hosil bo'ladi, ularning har biri ikkita bakterial xlorofill (BChl) a molekulalari va bitta yoki ikkita karotinoidlarni bog'laydi (8-12). Eng oddiy LH1 antennasi RC (9-13) ni yopiq halqada o'rab turgan 16 yoki 17 αβ geterodimerlardan iborat, ammo boshqa yadro komplekslarida transmembran peptidlar atrofdagi LH1 ning uzluksizligini buzadi va shu bilan RC va sitoxrom bc1 kompleksi o'rtasidagi xinol/xinon diffuziyasini rag'batlantiradi (11, 13-15). Binafsha fototrofik o'simlik Rhodopseudomonas (Rps.) fotosintezni qo'llab-quvvatlaydigan energiya va elektron uzatishni tushuna oladigan model organizmdir. Rps ning birinchi kristall tuzilishi. Palustris RC-LH1 kompleksining modeli RC bo'lib, 15 ta geterodimerik LH1 halqalari bilan o'ralgan bo'lib, ular "Protein W" deb nomlangan noma'lum oqsil tomonidan uziladi (14). Keyinchalik Protein-W RPA4402 sifatida aniqlandi, bu uchta taxmin qilingan transmembran spirallari (TMH) bo'lgan xaraktersiz 10,5 kDa oqsildir (16). Biz W oqsilini kodlovchi rpa4402 genini RC-L, M (pufL, pufM) va LH1α, β (pufA, pufB) subbirliklarini kodlovchi genlar uchun ishlatiladigan nomenklaturaga mos kelishi uchun pufW ga o'zgartirishni taklif qilamiz. Qizig'i shundaki, W proteini RC-LH1 ning atigi 10% da mavjud bo'lib, Rps. palustris ikkita turli RC-LH1 komplekslarini ishlab chiqarishini ko'rsatadi. Bu yerda biz ikkita yadro komplekslarining yuqori aniqlikdagi krio-EM (krio-EM) tuzilmalarini taqdim etamiz, biri W proteini va 14 αβ heterodimerlari bilan, ikkinchisi W proteinisiz va yopiq 16 Heterodimer LH1 halqasi bilan. Bizning tuzilishimiz Rps. palustris ning RC-LH1 kompleksini tushunishda bosqichma-bosqich o'zgarishni ifodalaydi, chunki biz har bir variantning bir hil populyatsiyasini tahlil qildik va har bir peptid va bog'langan pigmentlarni hamda tegishli lipidlar va xinonlarni aniq belgilash uchun yetarli aniqlikka egamiz. Ushbu tuzilmalarni taqqoslash shuni ko'rsatadiki, hozirgacha boshqa biron bir RC-LH1 kompleksida topilmagan uchta TMH oqsili-W xinon/xinon almashinuvini tezlashtirish uchun xinon kanalini hosil qiladi. Bir qator saqlanib qolgan lipid va xinon bog'lanish joylari aniqlandi va biz xinon va RC kombinatsiyasidan keyin yangi konformatsion o'zgarishni aniqladik, bu kislorodli fototrof organizmlarning fotosistema II (PSII) RC uchun mos bo'lishi mumkin. Bizning topilmalarimiz binafsha fototrof bakteriyalarning RC-LH1 yadro kompleksida xinon/xinon bog'lanish va almashinuv kinetikasi haqida yangi tushunchalar beradi.
Rps. palustrisda topilgan ikkita kompleksni batafsil o'rganishni osonlashtirish uchun biz har bir RC-LH1 ni biokimyoviy usullar bilan ajratib oldik. Oqsil W-tanqis kompleksi (bundan keyin ΔpufW deb yuritiladi) pufW geni bo'lmagan shtammdan tozalangan (16) va faqat bitta RC-LH1 kompleksi ishlab chiqarilishi mumkin. Oqsil W o'z ichiga olgan kompleks shtamm tomonidan ishlab chiqariladi. Ushbu shtammning W oqsili C-terminalida 10x His yorlig'i bilan modifikatsiyalangan, shuning uchun W oqsili o'z ichiga olgan kompleks metallni immobilizatsiya qilish orqali ko'pgina yetishmayotgan W oqsili bilan samarali birlashtirilishi mumkin. Kompleks samarali ravishda ajratilgan (16) Affinity Chromatografiyasi (IMAC).
1-rasmda ko'rsatilganidek, ikkala kompleks ham LH1 antennasi bilan o'ralgan uchta kichik birlik RC (RC-L, RC-M va RC-H) ni o'z ichiga oladi. Protein-W ga ega bo'lmagan kompleksning 2.80-A tuzilishi 16 ta αβ geterodimerni ko'rsatadi, bu esa RC ni butunlay o'rab turgan yopiq LH1 halqasini hosil qiladi, bundan keyin RC-LH116 kompleksi deb ataladi. Protein-W o'z ichiga olgan kompleksning 2.65Å tuzilishi protein-W tomonidan uzilgan 14-geterodimer LH1 ga ega, bundan keyin RC-LH114-W deb ataladi.
(A va B) Birikmaning sirt ko'rinishi. (C va D) Tayoqchalarda ifodalangan bog'langan pigmentlar. (E va F) Sitoplazmatik sirtdan kuzatilgan komplekslar multfilmlarda ko'rsatilgan peptidlar va LH1 subbirliklariga ega va oqsil-W oralig'idan soat yo'nalishi bo'yicha raqamlangan [Rba raqamlashiga mos keladi. sphaeroides kompleksi (13)]. LH1-α uchun oqsil subbirligining rangi sariq; LH1-β uchun oqsil subbirligining rangi ko'k; oqsil-W uchun oqsil qizil; RC-H uchun ko'k; RC-L uchun to'q sariq; RC-M uchun binafsha rang. Kofaktorlar tayoqchalar bilan ifodalanadi, yashil rang BChl va BPh a molekulalarini, binafsha rang karotinoidlarni va sariq rang UQ10 molekulalarini ifodalaydi. (G va H) RC-LH114-W kompleksi (G) va RC-LH116 kompleksi (H) ning ekvivalent mintaqasida oqsil-W oralig'ining kattalashtirilgan ko'rinishi. Kofaktorlar bo'shliqni to'ldirish shaklida, xelatlangan xinon ko'k rangda ko'rsatiladi. Oqsil-W oralig'i (G) da ko'k chiziqli chiziq bilan, xinon/xinolol LH116 halqasida tarqaladigan kichik teshiklar esa (H) da qora chiziqli chiziq bilan ta'kidlangan.
1-rasmda (A va B) LH1αβ geterodimerlarining ochiq yoki yopiq massivlari bilan o'ralgan RC ko'rsatilgan, ularning har biri ikkita BChl va bitta karotenoid bilan bog'lanadi (1-rasm, C va D). Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Rps LH1 kompleksidir. Spirulina ksantinining biosintetik yo'lida bu turlar karotenoidlarning aralash populyatsiyalarini o'z ichiga oladi (17). Biroq, spiropirroksantin dominant karotenoid bo'lib, uning zichligi qoniqarli. Shuning uchun biz spiroksantinni barcha LH1 bog'lanish joylarida modellashtirishni tanladik. Alfa va beta polipeptidlari qisqa membranali tashqi mintaqalarga ega bo'lgan bitta TMHlardir (1-rasm, A, B, E va F). C-terminalda 17 ta qoldiqning zichligi kuzatilmagan bo'lsa-da, alfa polipeptid ikkala kompleksda ham Met1 dan Ala46 gacha bo'lingan. RC-LH116 da β polipeptidi Gly4 dan Tyr52 gacha va RC-LH114-W da Ser5 dan Tyr52 gacha kamaydi. 3 yoki 4 N-terminal yoki 13 C-terminal qoldiqlarining zichligi kuzatilmadi (S1-rasm). Yovvoyi tipdagi shtammdan tayyorlangan aralash RC-LH1 kompleksining massa spektrometriyasi tahlili shuni ko'rsatdiki, yo'qolgan mintaqa bu peptidlarning geterologik bo'linishi natijasidir (S1 va S2-rasmlar). α-Met1 ning N-terminalli formillanishi ham kuzatildi (f). Tahlil shuni ko'rsatdiki, α-peptid fMet1 dan Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 gacha bo'lgan qoldiqlardan, β-peptid esa Ser2 dan Ala53 gacha bo'lgan qoldiqlardan iborat bo'lib, bu past haroratli EM zichlik xaritasi bilan yaxshi mos keladi.
α-His29 va β-His36 ning koordinatsiyasi BChls ni yuzma-yuz qiladi; har bir αβ geterodimeri qo'shnilari bilan birlashib, RC atrofida ochiq halqa (RC-LH114-W) yoki yopiq halqa (RC-LH116) hosil qiladi. Eksiton bilan bog'langan pigment massivi (1-rasm, C va D). RC-LH114-W ning 877 nm diapazoni bilan taqqoslaganda, RC-LH116 ning 880 nm yutilish qizil siljishi 3 nm ni tashkil qiladi (2A-rasm). Biroq, dumaloq dikroizm spektri deyarli bir xil (2B-rasm), bu ochiq va yopiq halqalar o'rtasida aniq farq bo'lsa-da, BChls ning mahalliy muhiti juda o'xshashligini ko'rsatadi. Yutilish qizil siljishi yopiq halqada issiqlik harakatining pasayishi va barqarorlikning oshishi (18, 19), yopiq halqa tufayli pigment birikmasining o'zgarishi (20, 21) yoki bu ikki ta'sirning kombinatsiyasi (11) natijasi bo'lishi mumkin.
(A) Ultrabinafsha/ko'rinadigan/yaqin infraqizil yutilish spektri, uning cho'qqilari mos keladigan pigmentlar bilan belgilangan va 775 nm da BPh cho'qqisiga normallashtirilgan. (B) 805 nm da BChl yutilishiga normallashtirilgan aylana dixroizm spektri. (C va D) RC-LH114-W kompleksi (C) va RC-LH116 kompleksining (D) vaqt bo'yicha aniqlangan yutilish spektrlaridan tanlangan ΔA spektrlari. Yaxshiroq taqqoslash uchun barcha spektrlar 0,2 ps da −A ning ∆A ga normallashtirilgan. (E) UQ2 ning turli konsentratsiyalari ishtirokida nurlanishdan keyin sitoxrom c2 oksidlanish tezligi (xom ma'lumotlar uchun S8-rasmga qarang). (F) Past, o'rta yoki yuqori intensivlikdagi yorug'lik ostida o'stirilgan hujayralarda (mos ravishda 10, 30 yoki 300μMm-2 s-1), tozalangan kompleksdagi W oqsili va RC-L subbirliklari va ajratilgan membrana nisbati. SDS-poliakrilamid gel elektroforezi va immunoassay yordamida oqsil darajasini aniqlang (xom ma'lumotlar uchun S9-rasmga qarang). Tozalangan RC-LH114-W kompleksiga nisbatan nisbatni aniqlang. Kompleksning RC-L ning oqsil-W ga stexiometrik nisbati 1:1 ga teng.
RC-LH114-W ning deformatsiyalangan αβ14 halqasidagi 1-holatdagi BChllar (1-rasm, A, C va E) RC birlamchi donorga (P) RC-LH116 dagi ekvivalent BChllarga qaraganda 6,8Å ga yaqinroq (1-rasm, B, D va F va S3-rasm); ammo, ikkita kompleksning o'tkinchi yutilish kinetikasi shuni ko'rsatadiki, RC-LH114-W va RC-LH116 uchun LH1 dan RC ga qo'zg'alish energiyasini uzatish vaqti konstantalari 40 ±4 va 44±3 ps ni tashkil qiladi (2-rasm). , C va D, S4-rasm va S2-jadval). RC ichida elektron uzatishda ham sezilarli farq yo'q (S5-rasm va tegishli qo'shimcha matn). Biz LH1 va RC-P o'rtasidagi energiya uzatish vaqtining yaqin mos kelishi ikkita LH1 halqasidagi ko'pgina BChllarning o'xshash masofasi, burchagi va potentsial energiyasi bilan bog'liq deb taxmin qilamiz. Minimal masofaga yetib borish uchun LH1 energiya naqshini o'rganish, suboptimal joylardan RC ga to'g'ridan-to'g'ri energiya uzatishdan tezroq emasdek tuyuladi. RC-LH114-W dagi ochiq halqali LH1 halqasi strukturaviy tahlil uchun past harorat sharoitida ham ahamiyatsiz issiqlik harakatiga duch kelishi mumkin va xona haroratida RC 1 pozitsiyasidagi βBChls pigmentatsiya masofasidan uzunroq αβ14 halqa konformatsiyasi mavjud.
RC-LH116 kompleksi 32 ta BChl va 16 ta karotinoidni o'z ichiga oladi va uning umumiy joylashuvi Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 shtammidan (PDB ID 7C9R) (12) va yashil suv o'tlaridan (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) olingan joylashuv bilan bir xil. Hizalanishdan so'ng, αβ geterodimerlarining pozitsiyalarida, ayniqsa 1-5, 15 va 16 da, faqat kichik og'ishlar kuzatildi (S6-rasm). Protein-W ning mavjudligi LH1 tuzilishiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi. Uning uchta TMHsi qisqa halqalar orqali bog'langan, N-terminal kompleksning lümen tomonida va C-terminal sitoplazmatik tomonda joylashgan (1A va 3-rasmlar, A dan D gacha). Protein-W asosan gidrofob (3B-rasm) va TMH2 va TMH3 transmembran yuzasini hosil qilish uchun LH1αβ-14 bilan o'zaro ta'sir qiladi (3-rasm, B va E dan G gacha). Interfeys asosan transmembran mintaqasidagi Phe, Leu va Val qoldiqlaridan iborat. Bu qoldiqlar gidrofob aminokislotalar va αβ-14 pigmentlari bilan to'plangan. Ba'zi qutb qoldiqlari ham o'zaro ta'sirga hissa qo'shadi, jumladan, kompleks bo'shliq yuzasida W-Thr68 va β-Trp42 orasidagi vodorod bog'lanishi (3-rasm, F va G). Sitoplazma yuzasida Gln34 αβ-14 karotenoidlarining keto guruhiga tutashgan. Bundan tashqari, n-dodetsil β-d-maltozid (β-DDM) molekulasi hal qilindi va uning gidrofob dumi oqsil-W va αβ-14 orasidagi interfeysgacha cho'zildi va lipid dumi tanada joylashgan bo'lishi mumkin. Shuningdek, biz W oqsili va RCH ning C-terminal aniqlik mintaqalari juda yaqin, ammo ma'lum o'zaro ta'sirlarni hosil qilish doirasiga kirmasligini payqadik (1-rasm, A va E). Biroq, bu ikki oqsilning aniqlanmagan C-terminal aminokislotalarida o'zaro ta'sirlar bo'lishi mumkin, bu esa RC-LH114-W kompleksini yig'ish paytida protein-W ni jalb qilish mexanizmini ta'minlashi mumkin.
(A) LH1αβ14 bilan chegaraga multfilm shaklida qaragan Protein-W elektrostatik potensial diagrammasining bir qismida ko'rsatilgan tayoqcha shaklidagi yon zanjirga (qizil) ega (kontur darajasi 0,13 bo'lgan shaffof kulrang sirt). (B) Protein-W gidrofob rangli sirt bilan ifodalanadi. Qutb va zaryadlangan joylar ko'k rangda, gidrofob joylar oq rangda va kuchli gidrofob joylar to'q sariq rangda ko'rsatiladi. (C va D) Protein-W multfilmda ifodalangan, uning yo'nalishi (A) (C) dagi bilan bir xil va 180° (D) ga aylantirilgan. Ketma-ketlikdagi pozitsiyaga ko'ra, ajralib turadigan qoldiqlar kamalak rang sxemasini qabul qiladi, bu yerda N-terminal ko'k va C-terminal qizil rangda. (E) (A) dagi bilan bir xil ko'rinishdagi Protein-W va oqsil-W:LH1 chegarasidagi qoldiqlar biriktirilgan belgilarga ega tayoqchalar bilan ifodalanadi. (F) Protein-W multfilm tasvirida (E) va LH1αβ14 ga nisbatan 90°, shuningdek, chiziq tasvirida interfeys qoldiqlariga nisbatan aylantirilgan. Beta polipeptiddan osilib turgan qoldiqlar belgilangan. Kofaktor 1-rasm rangiga mos keladigan chiziq sifatida, parchalangan β-DDM kulrang rangda va kislorod qizil rangda ko'rsatilgan. (G) (F) dagi ko'rinish 180° ga aylantirilgan, belgilangan alfa polipeptidning ko'zga ko'ringan qoldiqlari ko'rsatilgan.
Protein-W αβ geterodimerini (1F-rasmdagi 15-chi) almashtiradi, shu bilan halqa yopilishiga va dastlabki uchta αβ geterodimerining qiyshayishiga yo'l qo'ymaydi. Birinchi αβ-1 geterodimerining plyonka normaliga nisbatan maksimal qiyalik burchagi 25° dan 29° gacha ekanligi kuzatildi (1-rasm, A va E), bu RC A o'tkir kontrastli-LH116 da αβ-1 ning 2° dan 8° gacha qiyalik bilan hosil qilingan (1-rasm, B va F). Ikkinchi va uchinchi geterodimerlar mos ravishda 12° dan 22° gacha va 5° dan 10° gacha qiyalikda. RC ning sterik to'siqligi tufayli αβ-1 ning qiyalik qismi αβ ning ikkinchi juftligini o'z ichiga olmaydi (bu 1F-rasmdagi 16-αβ ga mos keladi), shu bilan LH1 halqasida aniq bo'shliq hosil qiladi (1-rasm, A va E). Ikkita αβ geterodimerining yo'qligi, to'rtta BChl va ikkita karotenoidning yo'qolishi bilan birga, karotenoidlarning hech biri buralgan αβ-1 subbirligiga bog'lanmaydi, natijada 13 ta Vegetarian va 28 ta BChl karotenoidlarini o'z ichiga olgan LH114-W halqasi hosil bo'ladi. αβ1 dan 7 gacha bo'lgan mintaqalardagi ikkita kompleksning mahalliy aniqlik baholari LH1 halqasining qolgan qismiga qaraganda pastroq, bu RC QB joyiga tutashgan LH1 subbirligining ichki plastikligini aks ettirishi mumkin (4-rasm).
RC-LH114-W (A va B) va RC-LH116 (C va D) rasmlari 1-rasmdagi (B va D) bir xil yuqori ko'rinish/yon ko'rinish (A va B) (A va C) va bo'shliq yuzasidan ko'rsatilgan. Rangli tugmalar o'ng tomonda ko'rsatilgan.
Stexiometrik nisbati 1:14 bo'lgan yagona xarakterli yadro kompleksi Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeridir (13). Biroq, W oqsili va PufX aniq gomologiyaga ega emas va ularning tegishli LH1 tuzilmalariga sezilarli ta'sir ko'rsatadi. PufX - bu RC-H subbirligining (13) sitoplazmatik tomoni bilan Rps. palustris LH116αβ-16 ga mos keladigan holatda o'zaro ta'sir qiluvchi N-terminal sitoplazmatik domenga ega bo'lgan yagona TMH. PufX RC-LH1 va sitoxrom bcl kompleksi o'rtasida xinon/xinolon almashinuvi uchun kanal yaratadi va barcha Rba.sphaeroides yadro kompleksida mavjud (13). Monomer-monomer interfeysi Rba da bo'lsa-da. RC-LH1-PufX dimeri sfaeroideslari RC-LH114-W da W oqsilining bog'lanish holatida joylashgan va PufX va protein-W tomonidan induktsiyalangan bo'shliq ekvivalent holatda (S7A-rasm). RC-LH114-W dagi bo'shliq, shuningdek, W yoki PufX oqsiliga aloqador bo'lmagan peptidlar tomonidan hosil qilingan Pseudomonas rosea LH1 ning gipotetik kinon kanali (8) bilan mos keladi (S7B-rasm). Bundan tashqari, Blc dagi kinon kanali. Bitta γ kichik birligini (7) chiqarib tashlash natijasida hosil bo'lgan zumrad yashil LH1 shunga o'xshash holatda joylashgan (S7C-rasm). Turli oqsillar vositachiligida bo'lsa-da, bu kinon/kinolol kanallarining RC-LH1 kompleksida umumiy holatda paydo bo'lishi konvergent evolyutsiyaga misol bo'lib ko'rinadi, bu W oqsili tomonidan yaratilgan bo'shliq kinon kanali vazifasini bajarishi mumkinligini ko'rsatadi.
LH114-W halqasidagi bo'shliq, oqsillardagi kabi oqsil teshigi orqali ikkita domenni bog'lash o'rniga, RC-LH114-W kompleksining ichki bo'shlig'i va asosiy membrana o'rtasida uzluksiz membrana mintaqasini hosil qilish imkonini beradi (1G-rasm). RC-LH116 kompleksi yopiq Tch. Ignasimon kompleksga o'xshaydi (22) (1H-rasm). Xinonning membrana orqali diffuziyasi tor oqsil kanali orqali diffuziyaga qaraganda tezroq bo'lgani uchun, ochiq LH114-W halqasi yopiq LH116 halqasiga qaraganda tezroq RC aylanishini ta'minlashi mumkin va xinonning RCga diffuziyasi cheklanganroq bo'lishi mumkin. W oqsili xinonlarning RC orqali konversiyasiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz ubixinon 2 (UQ2) ning ma'lum bir konsentratsiyasida (qisqaroq izopren dumli tabiiy UQ10 analogi) sitoxrom oksidlanish tahlilini o'tkazdik (2E-rasm). Xelatlangan xinonning mavjudligi Michaelis doimiysining aniq qiymatini aniqlashga to'sqinlik qilsa-da (RC-LH114-W va RC-LH116 mos ravishda 0,2±0,1μM va 0,5±0,2μM uchun mos keladi), RC-LH114-W ning maksimal tezligi (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 ga (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) nisbatan 28±5% ga katta.
Dastlab biz oqsil-W yadro kompleksining taxminan 10% da mavjudligini taxmin qildik (16); bu yerda kam yorug'likli, o'rtacha yorug'likli va yuqori yorug'likli o'sish hujayralarining bandlik darajasi mos ravishda 15±0,6%, 11±1% va 0,9±0,5% ni tashkil qiladi (2F-rasm). Mass-spektrometriyani miqdoriy taqqoslash shuni ko'rsatdiki, gistidin yorlig'i qo'shilishi yovvoyi turdagi shtammlarga nisbatan oqsil-W ning nisbiy miqdorini kamaytirmadi (P = 0,59), shuning uchun bu darajalar modifikatsiyalangan oqsil-W ning artefakti emas (S10-rasm). Biroq, RC-LH1 kompleksidagi oqsil-W ning bu past bandligi ba'zi RC larning tezlashtirilgan tezlikda aylanishiga imkon berishi mumkin, shu bilan RC-LH116 kompleksidagi sekinroq xinon/xinolon almashinuvini yumshatadi. Biz yuqori yorug'lik bandlik darajasi so'nggi transkriptomika ma'lumotlariga mos kelmasligini payqadik, bu esa pufW genining ifodasi kuchli yorug'lik ostida oshishini ko'rsatadi (S11-rasm) (23). PufW transkripsiyasi va oqsil-W ning RC-LH1 kompleksiga qo'shilishi o'rtasidagi farq chalkash va oqsilning murakkab regulyatsiyasini aks ettirishi mumkin.
RC-LH114-W da 6 ta kardiolipin (CDL), 7 ta fosfatidilxolin (POPC), 1 ta fosfatidilgliserol (POPG) va 29 ta β-DDM molekulalari ajratilgan va modellashtirilgan: 6 ta CDL, 24 ta POPC, 2 ta POPG va 12 ta βDDM. RC-LH116 (5-rasm, A va B). Bu ikki strukturada CDL deyarli kompleksning sitoplazmatik tomonida joylashgan, POPC, POPG va β-DDM esa asosan lyuminal tomonda joylashgan. RC-LH114-W kompleksining αβ-1 dan αβ-6 gacha bo'lgan qismida ikkita lipid va yuvish vositasi molekulasi ajratilgan (5A-rasm) va beshtasi RC-LH116 ning ekvivalent sohasida ajratilgan (5B-rasm). Kompleksning boshqa tomonida, asosan CDLda, RC va αβ-7 dan αβ-13 gacha to'plangan ko'proq lipidlar topildi (5-rasm, A va B). Boshqa strukturaviy jihatdan erigan lipidlar va yuvish vositalari LH1 halqasidan tashqarida joylashgan va yaxshi erigan asil zanjirlari LH1 subbirliklari orasida cho'zilgan, RC-LH114-W da β-DDM sifatida belgilangan va β-DDM va POPC-LH116 ning RC A aralashmasida β-DDM sifatida belgilangan. Bizning tuzilishimizdagi xelatlovchi lipidlar va yuvish vositalarining o'xshash pozitsiyalari ularning fiziologik jihatdan muhim bog'lanish joylari ekanligini ko'rsatadi (S12A-rasm). Tchdagi ekvivalent molekulalarning pozitsiyalari ham yaxshi konsistentsiyaga ega. Gentle va Trv. 970 RC-LH1s shtammi (S12-rasm, B dan E gacha) (9, 12) va lipid bosh guruhining vodorod bog'lanish qoldiqlari ketma-ketlik hizalanishida ancha yaxshi saqlanish ko'rsatdi (S13-rasm), bu RC ga bog'langan CDL saqlanib qolganligini ko'rsatadi (24), bu joylar RC-LH1 kompleksida saqlanishi mumkin.
(A va B) RC-LH114-W (A) va RC-LH116 (B) peptidlari multfilmlar bilan, pigmentlar esa 1-rasmdagi rang sxemasidan foydalanib, tayoqchalar bilan ifodalangan. Lipidlar qizil rangda, yuvish vositalari esa kulrang rangda ko'rsatilgan. RC QA va QB joylariga bog'langan UQ sariq rangda, ajratilgan UQ esa ko'k rangda. (C va D) (A) va (B) bilan bir xil ko'rinishlar, lipidlar tushirib qoldirilgan. (E dan G gacha) RC-LH116 dan olingan Q1(E), Q2(F) va Q3(G) ning bir-biriga ta'sir qiluvchi yon zanjirlar bilan kattalashtirilgan ko'rinishi. Vodorod bog'lanishlari qora punktir chiziqlar sifatida ko'rsatilgan.
RC-LH116 da zaryadni ajratish jarayonida elektron uzatishda ishtirok etadigan RC QA va QB UQ bog'lanish joylarida parchalanadi. Biroq, RC-LH114-W da QB xinon ajratilmagan va quyida batafsil muhokama qilinadi. QA va QB xinonlaridan tashqari, ikkita xelatlangan UQ molekulasi (RC va LH1 halqalari orasida joylashgan) RC-LH114-W tuzilishida ularning yaxshi ajratilgan bosh guruhlariga (mos ravishda Q1 va Q2 da joylashgan) ko'ra ajratilgan. bo'sh joy). 5C-rasm). Q1 ga ikkita izopren birligi biriktirilgan va zichlik xaritasi Q2 ning to'liq 10 ta izopren dumini aniqlaydi. RC-LH116 tuzilishida uchta xelatlangan UQ10 molekulasi (Q1 dan Q3 gacha, 5D-rasm) ajratilgan va barcha molekulalar dum bo'ylab aniq zichlikka ega (5-rasm, D dan G gacha). Ikkala strukturada Q1 va Q2 xinon bosh guruhlarining pozitsiyalari juda yaxshi izchillikka ega (S12F-rasm) va ular faqat RC bilan o'zaro ta'sir qiladi. Q1 RC-LH114-W ning W oralig'ining kirish qismida joylashgan (1G va 5-rasm, C, D va E) va Q2 QB bog'lanish joyi yaqinida joylashgan (5-rasm, C, D) va F). Saqlangan L-Trp143 va L-Trp269 qoldiqlari Q1 va Q2 ga juda yaqin va potentsial π-ustma-ust tushish o'zaro ta'sirini ta'minlaydi (5-rasm, E va F va S12-rasm). Q1 ning distal kislorodidan 3,0 Å bo'lgan L-Gln88 kuchli vodorod bog'lanishini ta'minlaydi (5E-rasm); bu qoldiq eng uzoq aloqadan tashqari barcha RClarda saqlanadi (S13-rasm). L-Ser91 boshqa RClarning aksariyatida Thr o'rniga konservativ ravishda almashtiriladi (S13-rasm), Q1 ning metil kislorodidan 3,8 Angstromni tashkil qiladi va kuchsiz vodorod bog'lanishlarini ta'minlashi mumkin (5E-rasm). Q3 o'ziga xos o'zaro ta'sirga ega emasga o'xshaydi, lekin RC-M subbirligi va LH1-α 5 dan 6 gacha bo'lgan subbirlik orasidagi gidrofob mintaqada joylashgan (5-rasm, D va G). Q1, Q2 va Q3 yoki yaqin atrofdagi xelatlangan xinonlar ham Tch. Gentle, Trv. Strain 970 va Blc da eritildi. Iris tuzilishi (9, 10, 12) RC-LH1 kompleksida saqlangan yordamchi xinon bog'lanish joyiga ishora qiladi (S12G-rasm). RC-LH116 dagi beshta parchalangan UQ yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) bilan aniqlangan har bir kompleksning 5,8±0,7 qiymatiga yaxshi mos keladi, RC-LH114-W dagi uchta parchalangan UQ esa 6,2±0,3 dan pastroq. O'lchangan 6,2±0,3 qiymati (S14-rasm) strukturada hal qilinmagan UQ molekulalari mavjudligini ko'rsatadi.
Psevdo-simmetrik L va M polipeptidlarining har biri beshta TMH ni o'z ichiga oladi va bitta BChl dimerini, ikkita BChl monomerini, ikkita bakteriofag (BPh) monomerini va bitta Gem bo'lmagan temirni va bir yoki ikkita UQ10 molekulasini birlashtirgan heterodimerni hosil qiladi. Terminal keton guruhida vodorod bog'lanishlarining mavjudligi va uning Rps da ma'lum to'planishi orqali karotinoidlar cis-3,4-dehidroorhodopin deb nomlangan M-kichik birlikka kiritiladi. Turlar (25). RC-H ning tashqi membrana domeni membranaga bitta TMH bilan bog'langan. Umumiy RC tuzilishi o'zaro bog'liq turlarning (masalan, Rba) uchta kichik birligi RC ga o'xshaydi. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl va BPh makrosikllari, karotinoid asos va gem bo'lmagan temir, shuningdek, QA joyidagi UQ10 bosh guruhi va RC-LH116 dagi QB xinoni (S15-rasm) ushbu tuzilmalarning aniqlik diapazonida bir-biriga mos keladi.
QB joylarining bandlik darajasi har xil bo'lgan ikkita RC strukturasining mavjudligi QB xinon bog'lanishiga hamroh bo'lgan izchil konformatsion o'zgarishlarni o'rganish uchun yangi imkoniyat yaratadi. RC-LH116 kompleksida QB xinon to'liq bog'langan "proksimal" holatda joylashgan (26), ammo RC-LH114-W ning ajralishida QB xinon yo'q. RC-LH114-W da QB xinon yo'q, bu ajablanarli, chunki kompleks faol, strukturaviy jihatdan erigan QB xinonli RC-LH116 kompleksiga qaraganda ko'proq. Ikkala LH1 halqasi taxminan oltita xinonni xelatlasa-da, beshtasi yopiq RC-LH116 halqasida strukturaviy jihatdan erigan, faqat uchtasi esa ochiq RC-LH114-W halqasida strukturaviy jihatdan cheklangan. Ushbu strukturaviy buzilishning kuchayishi RC-LH114-W QB saytlarining tezroq almashinishini, kompleksda tezroq xinon kinetikasini va LH1 halqasini kesib o'tish ehtimolining oshishini aks ettirishi mumkin. Biz RC-LH114-W ning RC QB saytida UQ ning yo'qligi murakkabroq va faolroq kompleksning natijasi bo'lishi mumkinligini va RC-LH114-W ning QB sayti darhol UQ aylanmasida muzlab qolganligini taxmin qilamiz. Muayyan bosqich (QB saytiga kirish yopilgan) bu faollikning konformatsiyasini aks ettiradi.
QB bo'lmasa, L-Phe217 ning UQ10 bog'lanishiga mos kelmaydigan holatga aylanishi, chunki bu dumning birinchi izopren birligi bilan fazoviy to'qnashuvga olib keladi (6A-rasm). Bundan tashqari, aniq asosiy konformatsion o'zgarishlar, ayniqsa, L-Phe217 QB bog'lanish cho'ntagiga siljigan spiral de (TMH D va E orasidagi halqadagi qisqa spiral) va L-Tyr223 ning aylanishi (6A-rasm) M-Asp45 ramkasi bilan vodorod bog'lanishini uzish va QB bog'lanish joyining kirishini yopish uchun (6B-rasm). Spiral de o'z bazasida aylanadi, L-Ser209 ning Cα 0,33Å ga siljiydi, L-Val221Cα esa 3,52Å ga siljiydi. TMH D va E da ikkala strukturada ham ustma-ust tushadigan kuzatiladigan o'zgarishlar yo'q (6A-rasm). Biz bilganimizdek, bu tabiiy RCdagi QB saytini yopadigan birinchi tuzilma. To'liq (QB bilan bog'langan) struktura bilan taqqoslash shuni ko'rsatadiki, xinon kamaytirilishidan oldin, uni xinonga kiritish uchun konformatsion o'zgarish talab etiladi. L-Phe217 xinon bosh guruhi bilan π-ustma-ust tushish o'zaro ta'sirini hosil qilish uchun aylanadi va spiral tashqariga siljiydi, bu esa L-Gly222 skeleti va L-Tyr223 yon zanjiriga barqaror vodorod bog'lanish tuzilishiga ega vodorod bog'lanish tarmog'ini hosil qilish imkonini beradi (6-rasm, A va C).
(A) Gologramma (L zanjiri, to'q sariq/M zanjiri, binafsha rang) va apo (kulrang) strukturasining bir-birining ustiga chiqadigan multfilmi, unda kalit qoldiqlari tayoqchaga o'xshash tasvir shaklida ko'rsatilgan. UQ10 sariq chiziq bilan ifodalangan. Nuqtali chiziq butun strukturada hosil bo'lgan vodorod bog'lanishlarini ko'rsatadi. (B va C) Apolipoprotein va butun halqa strukturasining sirt tasviri, mos ravishda L-Phe217 ning yon zanjir kislorodini ko'k rangda va L-Tyr223 ning qizil rangda ta'kidlaydi. L subbirligi to'q sariq rangda; M va H subbirliklari ranglanmagan. (D va E) Apolipoprotein (D) va butun (E) RC QB joylari [mos ravishda (A) bo'yicha ranglang] va Thermophilus thermophilus PSII (yashil, plastik xinonli ko'k; PDB ID: 3WU2) Tekislang (58).
Kutilmaganda, LH1siz QB yetishmaydigan RClarning bir nechta tuzilmalari mavjud bo'lsa-da, ushbu tadqiqotda kuzatilgan konformatsion o'zgarishlar ilgari xabar qilinmagan. Bularga Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) va Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) dan olingan QB kamayish tuzilishi kiradi, ularning barchasi ularning umumiy QB tuzilishi bilan deyarli bir xil. 3PRC ni sinchiklab tekshirish shuni ko'rsatdiki, LDAO (Lauril Dimetil Amin Oksid) yuvish vositasi molekulalari QB pozitsiyasining kirish qismida bog'lanadi, bu esa yopiq konformatsiyaga qayta joylashishni oldini olishi mumkin. LDAO 1EYS yoki 1OGV da bir xil holatda parchalanmasa ham, bu RClar bir xil yuvish vositasi yordamida tayyorlanadi va shuning uchun bir xil ta'sir ko'rsatishi mumkin. Rba ning kristall tuzilishi. Sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) bilan birgalikda kristallangan Sphaeroides RC ham yopiq QB saytiga ega ko'rinadi. Biroq, bu holda, RC-M polipeptidining N-terminal mintaqasi (Q spiralidagi Tyr qoldig'ining H bog'lanishi orqali QB bog'lanish joyi bilan o'zaro ta'sir qiladi) g'ayritabiiy konformatsiyani qabul qiladi va QB konformatsiya o'zgarishi qo'shimcha o'rganilmaydi (30). Tasalli beradigan narsa shundaki, biz RC-LH114-W strukturasida M polipeptidining bunday deformatsiyasini ko'rmadik, bu RC-LH116 RC ning N-terminal mintaqasi bilan deyarli bir xil. Shuni ham ta'kidlash kerakki, yuvish vositasiga asoslangan LH1 antennasi yo'q qilingandan so'ng, PDBdagi apolipoprotein RClar hal qilindi, bu esa RC va atrofdagi LH1 halqasining ichki yuzasi orasidagi bo'shliqdagi ichki xinon hovuzlari va lipidlarni yo'q qildi (31, 32). RC funktsional bo'lib qoladi, chunki u barcha kofaktorlarni saqlab qoladi, parchalanadigan QB xinoni bundan mustasno, u kamroq barqaror va tayyorlash jarayonida ko'pincha yo'qoladi (33). Bundan tashqari, RC dan LH1 va tabiiy tsiklik lipidlarni olib tashlash funktsiyalarga, masalan, zaryad bilan ajratilgan P+QB-holatining qisqarish muddatiga ta'sir qilishi mumkinligi ma'lum (31, 34, 35). Shuning uchun, biz RC atrofidagi mahalliy LH1 halqasining mavjudligi "yopiq" QB joyini saqlab qolishi va shu bilan QB yaqinidagi mahalliy muhitni saqlab qolishi mumkin deb taxmin qilamiz.
Apolipoprotein (QB xinonisiz) va to'liq struktura QB saytining aylanishining faqat ikkita suratini ifodalasa-da, bir qator hodisalar emas, balki gidroxinon tomonidan qayta bog'lanishning oldini olish uchun bog'lanishni amalga oshirish mumkinligiga ishora qiluvchi belgilar mavjud. Apolipoproteinning QB sayti yaqinidagi xinolol va xinonning o'zaro ta'siri har xil bo'lishi mumkin, bu esa uning RC tomonidan rad etilishiga olib keladi. Konformatsion o'zgarishlar xinonlarning bog'lanishi va kamayishida rol o'ynashi uzoq vaqtdan beri taklif qilingan. Muzlatilgan RClarning qorong'u moslashuvdan keyin xinonlarni kamaytirish qobiliyati buzilgan (36); Rentgen kristallografiyasi shuni ko'rsatadiki, bu shikastlanish QB xinonlarining faol proksimal pozitsiyadan taxminan 4,5 Å masofada "distal" konformatsiyada qolib ketishi bilan bog'liq (26), 37). Biz bu distal bog'lanish konformatsiyasi apolipoprotein va to'liq halqali struktura o'rtasidagi oraliq holatning surati ekanligini taxmin qilamiz, bu xinon bilan dastlabki o'zaro ta'sir va QB saytining ochilishidan keyin sodir bo'ladi.
Ba'zi fototrof bakteriyalar va siyanobakteriyalar, suv o'tlari va o'simliklarning PSII kompleksida topilgan II tipdagi RC strukturaviy va funktsional saqlanish xususiyatiga ega (38). 6-rasmda (D va E) ko'rsatilgan strukturaviy hizalanish PSII RClari va bakterial RC kompleksining QB sayti o'rtasidagi o'xshashlikni ta'kidlaydi. Bu taqqoslash uzoq vaqtdan beri xinon bog'lanish va qaytarilishning chambarchas bog'liq tizimlarini o'rganish uchun model bo'lib kelgan. Avvalgi nashrlarda konformatsion o'zgarishlar xinonlarning PSII qaytarilishi bilan birga kelishi taxmin qilingan (39, 40). Shuning uchun, RC ning evolyutsion saqlanishini hisobga olsak, ilgari kuzatilmagan bu bog'lanish mexanizmi kislorodli fototrof o'simliklardagi PSII RC ning QB saytiga ham tegishli bo'lishi mumkin.
Rps ΔpufW (yorliqsiz pufW o'chirish) va PufW-His (tabiiy pufW lokusidan ifodalangan C-terminal 10x His-yorliqlangan oqsil-W) shtammlari. palustris CGA009 avvalgi ishimizda (16) tasvirlangan. Bu shtammlar va izogen yovvoyi tipdagi ota-ona muzlatgichdan PYE (har biri 5 g litr -1) (LBda -80 °C da saqlangan, tarkibida 50% (w/v) glitserin) oqsili, xamirturush ekstrakti va suksinat) agar [1,5% (w/v)] plastinkasida oz sonli hujayralarni chizish orqali olingan. Plastinka xona haroratida anaerob sharoitda qorong'i joyda bir kechada inkubatsiya qilindi va keyin OSRAM 116-W halogen lampalar (RS Components, Buyuk Britaniya) tomonidan taqdim etilgan oq yorug'lik (~50 μmolm-2 s-1) bilan bitta koloniya paydo bo'lguncha 3 dan 5 kungacha yoritildi. Bitta koloniya 0,1% (w/v) kasaminokislotalar (bundan keyin M22 deb yuritiladi) bilan to'ldirilgan 10 ml M22+ muhitini (41) emlash uchun ishlatildi. Kultura kislorod kam bo'lgan sharoitda qorong'uda, 34°C da, 180 rpm tezlikda 48 soat davomida chayqatib o'stirildi va keyin 70 ml kultura 24 soat davomida xuddi shu sharoitda emlandi. 30 ml universal vintli shaffof shisha idishga 30 ml M22 muhitini emlash uchun 1 ml hajmdagi yarim aerob kultura ishlatiladi va 48 soat davomida steril magnit kuch bilan aralashtiruvchi tayoqcha yordamida aralashtiriladi (~50μmolm-2 s-1). Keyin 30 ml kultura xuddi shu sharoitda taxminan 1 litr kultura bilan emlandi, keyin esa 72 soat davomida ~200 μmolm-2 s-1 da yoritilgan taxminan 9 litr kulturani emlash uchun ishlatildi. Hujayralar 7132 RCF da 30 daqiqa davomida santrifugatsiya yo'li bilan yig'ib olindi, ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) da qayta eritib olindi va kerak bo'lguncha -20°C da saqlandi.
Eritilgandan so'ng, qayta suspenziyalangan hujayralarga deoksiribonukleaza I (Merck, Buyuk Britaniya), lizozim (Merck, Buyuk Britaniya) va ikkita Roche holoenzim proteaza inhibitori tabletkalari (Merck, Buyuk Britaniya) ning bir nechta kristallarini qo'shing. 20,000 psi fransuz bosimli hujayrasida (Aminco, AQSh) hujayralar 8 dan 12 martagacha parchalandi. Buzilmagan hujayralar va erimaydigan qoldiqlar 18,500 RCF da 4°C da 15 daqiqa davomida santrifugalash orqali olib tashlangandan so'ng, membrana pigmentli lizatdan 43,000°C da 2 soat davomida 113,000 RCF da santrifugalash orqali cho'ktirildi. Eriydigan fraksiyani tashlang va rangli membranani 100 dan 200 ml gacha 20 mM tris-HCl (pH 8.0) da qayta suspenziya qiling va ko'rinadigan agregatlar bo'lmaguncha gomogenlashtiring. Mualliflik huquqiga ega membrana 2% (w/v) β-DDM saqlovchi 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, AQSh) eritmasida 4°C da qorong'u joyda 1 soat davomida sekin aralashtirib inkubatsiya qilindi. Keyin qoldiq erimaydigan moddalarni olib tashlash uchun 150 000 RCF ni 4°C da 1 soat davomida eritish uchun 70°C da santrifuga qilindi.
ΔpufW shtammidan olingan eruvchan membrana 50 ml DEAE Sefaroza ion almashinuvi ustuniga uchta ustun hajmi (CV) bog'lash buferi [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM saqlovchi] bilan qo'llanildi. Ustunni ikkita CV bog'lash buferi bilan yuving, so'ngra ustunni 50 mM NaCl saqlovchi ikkita bog'lash buferi bilan yuving. RC-LH116 kompleksi 1.75 CV da 150 dan 300 mM NaCl gacha chiziqli gradiyent bilan (bog'lash buferida) elyut qilindi va qolgan bog'lash kompleksi 0.5 CV da 300 mM NaCl saqlovchi bog'lash buferi bilan elyut qilindi. 250 dan 1000 nm gacha bo'lgan yutilish spektrini to'plang, yutilish nisbati (A880/A280) 1 dan katta bo'lgan fraksiyani 880 dan 280 nm gacha bo'lgan joyda saqlang, uni bog'lash buferida ikki marta suyultiring va DEAE ustunida tozalashda xuddi shu protsedurani yana qo'llang. A880/A280 nisbatlari 1,7 dan yuqori va A880/A805 nisbatlari 3,0 dan yuqori bo'lgan fraksiyalarni suyultiring, ion almashinuvining uchinchi bosqichini bajaring va A880/A280 nisbatlari 2,2 dan yuqori va A880/A805 nisbatlari 5,0 dan yuqori bo'lgan fraksiyalarni saqlang. Qisman tozalangan kompleks Amicon 100,000 molekulyar og'irlikdagi kesish (MWCO) santrifüj filtrida (Merck, Buyuk Britaniya) ~2 ml gacha konsentratsiyalangan va 200 mM NaCl buferini o'z ichiga olgan Superdex 200 16/600 o'lchamdagi chiqarish ustuniga (GE Healthcare, AQSh) yuklangan va keyin 1,5 CV da xuddi shu buferda elyutlangan. O'lchamdagi chiqarish fraksiyasining yutilish spektrlarini to'plang va yutilish spektrlarini 2,4 dan yuqori A880/A280 va 5,8 dan 100 A880 gacha A880/A805 nisbatlari bilan konsentratsiyalang va darhol ularni krio-TEM panjarasini tayyorlash yoki saqlash uchun foydalaning. Zarur bo'lguncha -80°C da saqlang.
PufW-His shtammidan olingan eruvchan membrana IMAC buferidagi (GE Healthcare) 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ustuniga (200 mM NaCl va 0,03% (w/w)) 20 mM tris-HCl (pH 8.0)) surtildi. v) β-DDM]. Ustun beshta CV IMAC buferi bilan, so'ngra 10 mM gistidin o'z ichiga olgan beshta CV IMAC buferi bilan yuvildi. Yadro kompleksi ustundan 100 mM gistidin o'z ichiga olgan beshta IMAC buferi bilan elutatsiya qilindi. RC-LH114-W kompleksini o'z ichiga olgan fraksiya Amicon 100,000 MWCO filtri (Merck, Buyuk Britaniya) bilan jihozlangan aralashtiriladigan idishda ~10 ml gacha konsentratsiyalangan, bog'lash buferi bilan 20 marta suyultirilgan va keyin 25 ml ga qo'shilgan. DEAE Sepharose ustunida buferga bog'langan to'rtta CV oldindan ishlatiladi. Ustunni to'rtta CV bog'lash buferi bilan yuving, so'ngra kompleksni sakkizta CVda 0 dan 100 mM NaCl gacha bo'lgan chiziqli gradiyentda (bog'lash buferida) elyut qiling va qolgan to'rtta CVda 100 mM bog'lash buferi mavjud. Natriy xloridda elutatsiya qilingan qoldiq komplekslar A880/A280 nisbati 2,4 dan yuqori va A880/A805 nisbati 4,6 dan yuqori fraksiyalar bilan birgalikda Amicon 100,000 MWCO santrifüj filtrida ~2 ml gacha konsentratsiyalangan va oldindan 1,5 CV IMAC bilan to'ldirilgan. Bufer Superdex 200 16/600 o'lchamdagi chiqarib tashlash ustunini muvozanatlashtirdi va keyin xuddi shu buferda 1,5 CV ustida elutatsiya qilindi. Hajm-chiqarib tashlash fraktsiyalarining yutilish spektrlarini to'plang va yutilish spektrlarini 2.1 dan yuqori A880/A280 nisbatlari va 4.6 dan 100 A880 gacha bo'lgan A880/A805 nisbatlari bilan jamlang, ular darhol muzlatilgan TEM panjarasini tayyorlash uchun ishlatiladi yoki kerak bo'lguncha -80°C da saqlanadi.
Past haroratli TEM panjaralarini tayyorlash uchun Leica EM GP immersion muzlatgichi ishlatilgan. Kompleks IMAC buferida A880 dan 50 gacha suyultirildi va keyin 5 mkl yangi porlash bilan zaryadsizlangan QUANTIFOIL 1.2/1.3 uglerod bilan qoplangan mis to'riga (Agar Scientific, Buyuk Britaniya) yuklandi. Panjara 20°C va 60% nisbiy namlikda 30 soniya davomida inkubatsiya qilinadi, so'ngra 3 soniya davomida quritiladi va keyin -176°C da suyuq etanda so'ndiriladi.
RC-LH114-W kompleksining ma'lumotlari 300 kV tezlanish kuchlanishida ishlaydigan, nominal kattalashtirish 130 000 × va 20 eV energiyaga ega bo'lgan Titan Krios mikroskopi yordamida eBIC (Elektron Biotasvirlash Markazi) (Britaniya Olmos Yorug'lik Manbai) ga yozib olindi. Ma'lumotlarni to'plash uchun sanash rejimida tasvirlarni yozib olish uchun K2 cho'qqisi detektoriga ega Gatan 968 GIF Quantum ishlatilgan. Kalibrlangan piksel o'lchami 1.048Å va doza tezligi 3.83 e-Å-2s-1. Film 11 soniyada yig'ildi va uni 40 qismga bo'lindi. Mikroskopni qayta fokuslash uchun uglerod bilan qoplangan maydondan foydalaning va keyin har bir teshikdan uchta filmni to'plang. Jami 3130 ta film to'plandi, defokus qiymatlari -1 dan -3 μm gacha.
RC-LH116 kompleksi uchun ma'lumotlar Asterbury Biostructure Laboratory (Lids universiteti, Buyuk Britaniya) da xuddi shu mikroskop yordamida to'plangan. Ma'lumotlar 130 k kattalashtirish bilan hisoblash rejimida to'plangan va piksel o'lchami 4,6 e-Å-2s-1 dozasi bilan 1,065 Å ga kalibrlangan. Film 12 soniyada yozib olingan va 48 qismga bo'lingan. Jami 3359 ta plyonka to'plangan, defokus qiymatlari -1 dan -3 μm gacha.
Barcha ma'lumotlarni qayta ishlash Relion 3.0 quvur liniyasida (42) amalga oshiriladi. Dozani og'irlashtirish orqali nur harakatini to'g'rilash uchun Motioncorr 2 (43) dan foydalaning va keyin CTF (kontrast uzatish funktsiyasi) parametrini aniqlash uchun CTFFIND 4.1 (44) dan foydalaning. Ushbu dastlabki ishlov berish bosqichlaridan keyingi odatiy fotomikrograflar 2-rasmda ko'rsatilgan. S16. Avtomatik tanlash shabloni 250 pikselli kadrda va ikki o'lchovli (2D) tasnifga ega bo'lmagan holda 1000 ta zarrachaning taxminan 250 pikselini qo'lda tanlash orqali yaratiladi, shu bilan namunaviy ifloslanishga mos keladigan yoki aniqlanadigan xususiyatlarga ega bo'lmagan tasniflar rad etiladi. Keyin barcha mikrofotograflarda avtomatik tanlash amalga oshirildi va RC-LH114-W 849 359 zarrachani, RC-LH116 kompleksi esa 476 547 zarrachani tashkil etdi. Tanlangan barcha zarrachalar ikki bosqichli noaniq 2D tasnifidan o'tdi va har bir sinovdan so'ng, uglerod maydoniga mos keladigan zarrachalar, namunaviy ifloslanish, aniq xususiyatlar yo'qligi yoki kuchli ustma-ust tushgan zarrachalar rad etiladi, natijada mos ravishda 772 033 (90,9%) va 359 678 (75,5%) ga teng. RC-LH114-W va RC-LH116 ning 3D tasnifi uchun zarrachalar ishlatiladi. Dastlabki 3D mos yozuvlar modeli stoxastik gradient tushish usuli yordamida yaratilgan. Dastlabki modeldan mos yozuvlar sifatida foydalanib, tanlangan zarrachalar 3D da to'rtta toifaga tasniflanadi. Ushbu toifadagi modeldan mos yozuvlar sifatida foydalanib, eng katta toifadagi zarrachalarda 3D tozalashni amalga oshiring, so'ngra erituvchi maydonini qoplash uchun dastlabki 15Å past chastotali filtrdan foydalaning, yumshoq qirralarning 6 pikselini qo'shing va yuqori detektorning Gatan K2 cho'qqisi modulyatsiyasi uzatish funktsiyasini tuzatish uchun piksellarni qayta ishlang. RC-LH114-W ma'lumotlar to'plami uchun ushbu dastlabki model niqob chekkalaridagi kuchli zichlikni olib tashlash orqali o'zgartirildi (UCSF Chimera-dagi yadro kompleks zichligidan uzilgan). Olingan modellar (RC-LH114-W va RC-LH116 ning o'lchamlari mos ravishda 3,91 va 4,16 Å) 3D tasnifining ikkinchi bosqichi uchun ma'lumotnoma sifatida ishlatiladi. Foydalanilgan zarrachalar dastlabki 3D sinfiga guruhlangan va qo'shnichilik bilan kuchli korrelyatsiyaga ega emas. Bir-birining ustiga chiqadigan yoki aniq strukturaviy xususiyatlarning yo'qligi. 3D tasnifining ikkinchi bosqichidan so'ng eng yuqori o'lchamga ega kategoriya tanlandi [RC-LH114-W uchun bitta kategoriya 377 703 zarracha (44,5%), RC-LH116 uchun jami 260 752 zarracha (54,7%) bo'lgan ikkita kategoriya mavjud, bu yerda ular faqat kichik farq bilan dastlabki aylanishdan keyin hizalanganda bir xil bo'ladi]. Tanlangan zarrachalar 400 pikselli qutida qayta ekstraksiya qilinadi va 3D tozalash orqali tozalanadi. Erituvchi niqob dastlabki 15Å past chastotali filtr, 3 pikselli xarita kengaytmasi va 3 pikselli yumshoq niqob yordamida yaratiladi. Har bir zarracha uchun CTF tozalash, har bir zarracha uchun harakatni tuzatish va har bir zarracha uchun CTF tozalashning ikkinchi bosqichidan foydalanib, natijada olingan teksturani yanada tozalash uchun har bir bosqichdan so'ng 3D tozalash, erituvchi niqoblash va keyingi ishlov berish amalga oshiriladi. FSC (Fourie Shell Correlation Coefficient) chegara qiymati 0,143 dan foydalanib, RC-LH114-W va RC-LH116 ning yakuniy modellarining o'lchamlari mos ravishda 2,65 va 2,80Å ni tashkil qiladi. Yakuniy modelning FSC egri chizig'i 2-rasmda ko'rsatilgan. S17.
Barcha oqsil ketma-ketliklari UniProtKB dan yuklab olinadi: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) RC-L, RC-M va RC-H oqsil ketma-ketliklarini va Rba ning kristall tuzilishini o'z ichiga olgan RC ning gomologik modelini yaratish uchun ishlatilgan. sphaeroides RC shablon sifatida ishlatilgan (PDB ID: 5LSE) (46). Yaratilgan modelni xaritaga (47) moslashtirish, oqsil tuzilishini yaxshilash va kofaktor [4×BChlα (monomer kutubxonasi qoldig'i nomi = BCL), 2×BPhα (BPH), bir yoki ikki turdagi UQ10 (U10), bitta gem bo'lmagan temir (Fe) va bitta 3,4-digidrogeksakarbonilxolin (QAK)] qo'shish uchun Coot (48) dan foydalaning. QAK monomer kutubxonasida mavjud bo'lmaganligi sababli, u PHENIX (49) dagi eLBOW vositasi yordamida parametrlangan.
Keyin, LH1 kichik birligi qurildi. Dastlab, PHENIX (49) dagi avtomatik qurish vositasi xarita va LH1-α va LH1-β oqsil ketma-ketliklaridan foydalanib, LH1 ketma-ketligining bir qismini avtomatik ravishda qurish uchun ishlatilgan. Eng to'liq LH1 kichik birligini tanlang, uni ajratib oling va Cootga yuklang, undagi yo'qolgan ketma-ketlikni qo'lda qo'shing va ikkita BCl a (BCL) va spirilloksantin (CRT) qo'shishdan oldin butun tuzilmani qo'lda aniqlang [tegishli Rps ga muvofiq. LH1 kompleksining zichligi va ma'lum karotinoid tarkibi. Turlar (17)]. To'liq LH1 kichik birligini nusxalang va UCSF Chimera “Docking Map Tool” dan foydalanib, LH1 zichligining qo'shni model bo'lmagan maydoniga joylashtiring va keyin uni Cootda aniqlang; barcha LH1 kichik birliklari modellashtirilgunga qadar jarayonni takrorlang. RC-LH114-W tuzilishi uchun, Cootdagi taqsimlanmagan zichlikni ajratib olish orqali, oqsil USCF Chimera xaritasidagi qolgan oqsil bo'lmagan komponentlardan segmentlanadi va Autobuild vositasi dastlabki modelni va qolgan kichik birliklarni (protein-W) modellashtirishni o'rnatish uchun ishlatiladi. PHENIX (49) da. Coot (48) da hosil bo'lgan modelga yo'qolgan ketma-ketliklarni qo'shing va keyin butun kichik birlikni qo'lda aniqlang. Qolgan taqsimlanmagan zichlik lipidlar (CDL = CDL, POPC = 6PL va POPG = PGT ning PDB monomer kutubxonasi identifikatori), β-DDM yuvish vositasi (LMT) va UQ10 molekulalari (U10) kombinatsiyasiga mos keladi. Model statistikasi va moslikning vizual sifati yanada yaxshilanmaguncha, to'liq boshlang'ich modelni takomillashtirish uchun Coot (48) da PHENIX optimallashtirish (49) va qo'lda optimallashtirishdan foydalaning. Nihoyat, mahalliy xaritani aniqlashtirish uchun LocScale (50) dan foydalaning va keyin taqsimlanmagan zichlikni modellashtirishning bir nechta boshqa sikllarini, shuningdek, avtomatik va qo'lda optimallashtirishni bajaring.
Tegishli zichliklarda joylashgan tegishli peptidlar, kofaktorlar va boshqa lipidlar va xinonlar 1 va 2-rasmlarda ko'rsatilgan. S18 dan S23 gacha. Yakuniy modelning statistik ma'lumotlari S1-jadvalda keltirilgan.
Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, UV/Vis/NIR yutilish spektrlari Cary60 spektrofotometrida (Agilent, AQSh) 250 nm dan 1000 nm gacha bo'lgan 1 nm intervallarda va 0,1 s integratsiya vaqtida to'plangan.
Namunani 2 mm yo'l bilan kvarts kyuvetida A880 ning 1 ga suyultiring va 400 dan 1000 nm gacha bo'lgan yutilish spektrini to'plang. Dumaloq dixroik spektrlar Jasco 810 spektropolyarimetrida (Jasco, Yaponiya) 400 nm va 950 nm oralig'ida 1 nm oraliqda 20 nm min-1 skanerlash tezligida to'plandi.
Molar yo'q bo'lish koeffitsienti yadro kompleksini taxminan 50 ga teng A880 ga suyultirish orqali aniqlanadi. 10 mkl hajmni 990 mkl bog'lovchi bufer yoki metanolda suyultiring va BChl degradatsiyasini minimallashtirish uchun darhol yutilish spektrini to'plang. Har bir metanol namunasining BChl miqdori 54,8 mM-1 sm-1 ning 771 nm da yo'q bo'lish koeffitsienti bilan hisoblab chiqildi va yo'q bo'lish koeffitsienti aniqlandi (51). O'lchangan BChl konsentratsiyasini yadro kompleks konsentratsiyasini aniqlash uchun 32 (RC-LH114-W) yoki 36 (RC-LH116) ga bo'ling, keyin buferda to'plangan bir xil namunaning yutilish spektrini aniqlash uchun ishlatiladi. Yo'q bo'lish koeffitsienti. parallel. Har bir namuna uchun uchta takroriy o'lchovlar olindi va hisoblash uchun BChl Qy maksimalining o'rtacha yutilishidan foydalanildi. 878 nm da o'lchangan RC-LH114-W ning yo'q bo'lish koeffitsienti 3280±140 mM-1 sm-1 ni tashkil qiladi, 880 nm da o'lchangan RC-LH116 ning yo'q bo'lish koeffitsienti esa 3800±30 mM-1 sm-1 ni tashkil qiladi.
UQ10 (52) dagi usulga muvofiq miqdori aniqlandi. Qisqasi, teskari fazali HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC tizimi yordamida amalga oshirildi. Taxminan 0,02 nmol RC-LH116 yoki RC-LH114-W ni 0,02% (w/v) temir xlorid o'z ichiga olgan 50 mkl 50:50 metanol:xloroformda eriting va oldindan muvozanatlangan Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm ni × 25 sm ustunga 40°C da 1 ml-1 min-1 da HPLC erituvchisida (80:20 metanol:2-propanol) eriting. 275 nm (UQ10), 450 nm (karotinoidlar) va 780 nm (BChl) da 1 soat davomida absorbsiyani kuzatish uchun HPLC erituvchisida izokratik elyutatsiya qiling. 275 nm xromatogrammadagi cho'qqi 25,5 daqiqada integrallandi, unda boshqa aniqlanadigan birikmalar yo'q edi. Integratsiyalangan maydon 0 dan 5,8 nmol gacha bo'lgan sof standartlarni kiritish natijasida hisoblangan kalibrlash egri chizig'iga asoslanib, ajratib olingan UQ10 ning molyar miqdorini hisoblash uchun ishlatiladi (S14-rasm). Har bir namuna uchta takrorlashda tahlil qilindi va xabar qilingan xato o'rtacha qiymatning SD ga mos keladi.
Maksimal Qy yutilishi 0,1 ga teng bo'lgan RC-LH1 kompleksini o'z ichiga olgan eritma 30 μM kamaytirilgan ot yuragi sitoxromi c2 (Merck, Buyuk Britaniya) va 0 dan 50 μMUQ2 (Merck, Buyuk Britaniya) bilan tayyorlandi. Har bir UQ2 konsentratsiyasida uchta 1 ml namunalar tayyorlandi va o'lchashdan oldin qorong'ulikka to'liq moslashishini ta'minlash uchun qorong'uda 4°C da bir kecha davomida inkubatsiya qilindi. Eritma 300 nm olov/500 chiziqli panjara, 1,24 mm kirish, 0,12 mm o'rta va 0,6 mm chiqish yoriqlari bilan jihozlangan OLIS RSM1000 modulli spektrofotometrga yuklandi. Qo'zg'alish nurini istisno qilish uchun namunaviy fototuba va mos yozuvlar fotomultiplikatori naychasining kirish qismiga 600 nm uzunlikdagi o'tkazgich filtri qo'yildi. Yutilish 550 nm da 0,15 s integratsiya vaqti bilan kuzatildi. Qo'zg'alish nuri 880 nm M880F2 LED (Yorug'lik chiqaradigan diod) (Thorlabs Ltd., Buyuk Britaniya) dan DC2200 kontrolleri (Thorlabs Ltd., Buyuk Britaniya) orqali 90% intensivlikda optik tolali kabel orqali chiqariladi va yorug'lik manbasiga 90° burchak ostida chiqariladi. Namuna tomonidan dastlab so'rilmagan har qanday yorug'likni qaytarish uchun o'lchov nuri oynaga qarama-qarshi qo'yilgan. Yorug'lik 50 soniyadan oldin yutilishni 10 soniya kuzatib boring. Keyin xinololning sitoxrom c23+ ni o'z-o'zidan qaytarish darajasini baholash uchun yutilish qorong'ida 60 soniya davomida kuzatildi (xom ma'lumotlar uchun S8-rasmga qarang).
Ma'lumotlar 0,5 dan 10 s gacha bo'lgan chiziqli boshlang'ich tezlikni o'rnatish (UQ2 konsentratsiyasiga qarab) va har bir UQ2 konsentratsiyasida uchta namunaning tezligini o'rtacha hisoblash orqali qayta ishlandi. Tegishli yo'q qilish koeffitsienti bilan hisoblangan RC-LH1 konsentratsiyasi tezlikni katalitik samaradorlikka aylantirish uchun ishlatilgan, bu Origin Pro 2019 (OriginLab, AQSh) da chizilgan va ko'rinadigan Km va Kcat qiymatlarini aniqlash uchun Michaelis-Menten modeliga moslashtirilgan.
Vaqtinchalik yutilish o'lchovlari uchun RC-LH1 namunasi 50 mM natriy askorbat (Merck, AQSh) va 0,4 mM Terbutin (Merck, AQSh) o'z ichiga olgan IMAC buferida ~2μM gacha suyultirildi. Askorbin kislotasi qurbonlik elektron donori sifatida ishlatiladi va tert-butaklofen QB ingibitori sifatida asosiy RC donorining o'lchash jarayonida kamaygan holda (ya'ni fotooksidlanmagan holda) qolishini ta'minlash uchun ishlatiladi. Lazer yo'lidagi namunaning qo'zg'alish impulslari orasida qorong'ulikka moslashish uchun yetarli vaqtga ega bo'lishini ta'minlash uchun 2 mm optik yo'l uzunligiga ega bo'lgan maxsus aylanadigan katakchaga (diametri taxminan 0,1 m, 350 RPM) taxminan 3 ml namuna qo'shiladi. Namunani 880 nm da 1 kHz takrorlash tezligida (NIR uchun 20 nJ yoki Vis uchun 100 nJ) qo'zg'atish uchun Ti: Sapphire lazer tizimini (Spectra Physics, AQSh) kuchaytirish uchun ~100-fs lazer impulslaridan foydalaning. Ma'lumotlarni to'plashdan oldin, namunani taxminan 30 daqiqa davomida qo'zg'alish nuriga qo'ying. Ta'sir qilish QA inaktivatsiyasiga olib keladi (ehtimol, QA ni bir yoki ikki marta kamaytiradi). Ammo shuni yodda tutingki, bu jarayon qaytarilishi mumkin, chunki uzoq vaqt qorong'u moslashuvdan so'ng, RC asta-sekin QA faolligiga qaytadi. -10 dan 7000 ps gacha kechikish vaqti bilan o'tkinchi spektrlarni o'lchash uchun Helios spektrometri (Ultrafast Systems, AQSh) ishlatilgan. Ma'lumotlar to'plamlarini guruhlash, keyin birlashtirish va standartlashtirish uchun Surface Xplorer dasturidan (Ultrafast Systems, AQSh) foydalaning. Parchalanish bilan bog'liq differentsial spektrlarni olish uchun birlashtirilgan ma'lumotlar to'plamidan foydalanish uchun CarpetView dasturiy ta'minot paketidan (Light Conversion Ltd., Litva) foydalaning yoki Origin (OriginLab, AQSh) dagi bitta to'lqin uzunligidagi spektral evolyutsiyaga moslashish uchun asbob javobi bilan bir nechta eksponentlarni birlashtiruvchi funksiyadan foydalaning.
Yuqorida aytib o'tilganidek (53), RC va periferik LH2 antennasiga ega bo'lmagan LH1 kompleksini o'z ichiga olgan fotosintetik plyonka tayyorlandi. Membrana 20 mM tris (pH 8.0) da suyultirildi va keyin 2 mm optik yo'lga ega kvarts kyuvetasiga yuklandi. Namunani 540 nm da -10 dan 7000 ps gacha kechikish vaqti bilan qo'zg'atish uchun 30nJ lazer impulsi ishlatildi. Ma'lumotlar to'plamini Rps. pal namunasi uchun tavsiflanganidek qayta ishlang.
Membrana 150 000 RCF da 4°C da 2 soat davomida santrifüjlash orqali granulalarga aylantirildi, so'ngra uning 880 nm da yutilishi 20 mM tris-HCl (pH 8.0) va 200 mM NaCl da qayta suspenziya qilindi. Membranani 2% (w/v) β-DDM da 4°C da 1 soat davomida qorong'uda sekin aralashtirib eriting. Namuna 100 mM trietilamonyum karbonat (pH 8.0) (TEAB; Merck, Buyuk Britaniya) da 2.5 mg ml-1 oqsil konsentratsiyasiga suyultirildi (Bio-Rad tahlili). Keyingi ishlov berish avval nashr etilgan usuldan (54) amalga oshirildi, 50 mkg oqsilni 1% (w/v) natriy laurat (Merck, Buyuk Britaniya) o'z ichiga olgan jami 50 mkl TEAB ga suyultirishdan boshlandi. 60 soniya davomida ultratovush bilan ishlov berilgandan so'ng, u 37°C da 30 daqiqa davomida 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Buyuk Britaniya) bilan qaytarildi. S-alkillash uchun namunani 10 mM metil S-metiltiometansulfonat (Merck, Buyuk Britaniya) bilan inkubatsiya qiling va uni 200 mM izopropanol eritmasidan xona haroratida 10 daqiqa davomida qo'shing. Proteolitik hazm qilish 2 mkg tripsin/endoproteinaza Lys-C aralashmasi (Promega UK) qo'shilishi va 37°C da 3 soat davomida inkubatsiya qilinishi orqali amalga oshirildi. Laurat sirt faol moddasi 50 mkl etil asetat va 10 mkl 10% (v/v) LC sinfidagi trifluorosirka kislotasi (TFA; Thermo Fisher Scientific, Buyuk Britaniya) qo'shilishi va 60 soniya davomida vortekslash orqali ekstraksiya qilindi. Faza ajratish 15 700 RCF da 5 daqiqa davomida santrifugatsiya orqali amalga oshirildi. Ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq, peptidni o'z ichiga olgan pastki fazani ehtiyotkorlik bilan aspiratsiya qilish va tuzsizlantirish uchun C18 spin kolonnasi (Thermo Fisher Scientific, Buyuk Britaniya) ishlatilgan. Vakuum santrifugatsiyasi orqali quritilgandan so'ng, namuna 0,5% TFA va 3% asetonitrilda eritildi va 500 ng avvalroq batafsil bayon qilingan tizim parametrlaridan foydalangan holda massa spektrometriyasi bilan birgalikda nanoflow RP xromatografiyasi yordamida tahlil qilindi.
Rps. palustris proteome ma'lumotlar bazasini (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) qidirish uchun oqsilni identifikatsiyalash va miqdoriy aniqlash uchun MaxQuant v.1.5.3.30 (56) dan foydalaning. Mass-spektrometriya proteomikasi ma'lumotlari PXD020402 ma'lumotlar to'plami identifikatori ostida PRIDE hamkor ombori (http://proteomecentral.proteomexchange.org) orqali ProteomeXchange Alliancega saqlandi.
Elektrospray ionizatsiyasi massa spektrometriyasi bilan birgalikda RPLC yordamida tahlil qilish uchun RC-LH1 kompleksi yovvoyi turdagi Rps dan tayyorlandi. Avval nashr etilgan usul (16) yordamida palustris hujayralarida hosil bo'lgan oqsil konsentratsiyasi 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl va 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad tahlili)) DDM da 2 mg ml-1 ni tashkil etdi. Ishlab chiqaruvchining protokoliga ko'ra, 10 mkg oqsilni cho'ktirish usuli bilan ajratib olish uchun 2D tozalash to'plamidan (GE Healthcare, AQSh) foydalaning va cho'kmani 20 mkl 60% (v/v) chumoli kislotasi (FA), 20% (v/v) asetonitril va 20% (v/v) suvda eriting. Besh mikrolitr RPLC (Dionex RSLC) va massa spektrometriyasi (Maxis UHR-TOF, Bruker) yordamida tahlil qilindi. 60°C va 100μlmin -1 da ajratish uchun MabPac 1.2×100 mm ustunidan (Thermo Fisher Scientific, Buyuk Britaniya) foydalaning, 85% (v / v) erituvchi A [0.1% (v / v) FA va 0.02% (V/v) TFA suvli eritmasi] dan 85% (v/v) erituvchi B [90% (v/v) asetonitril TFA da 0.1% (v/v) FA va 0.02% (v/v)] gacha gradiyent bilan. Standart elektropurkagich ionlanish manbai va standart parametrlardan 60 daqiqadan ko'proq vaqt davomida foydalanib, massa spektrometri 100 dan 2750 m/z gacha (massa-zaryad nisbati) ga erishadi. ExPASy bioinformatika resurs portali FindPept vositasi (https://web.expasy.org/findpept/) yordamida massa spektrini kompleksning kichik birliklariga xaritalang.
Hujayralar 100 ml NF-past (10μMm-2 s-1), o'rta (30μMm-2 s-1) yoki yuqori (300μMm-2 s-1) yorug'lik ostida 72 soat davomida o'stirildi. M22 muhiti (ammoniy sulfat qo'shilmagan va natriy suksinat natriy asetat bilan almashtirilgan M22 muhiti) 100 ml vintli shishada (23). Beshta 30 soniyali siklda hujayralarni lizis qilish uchun 0,1 mikronli shisha boncuklar 1:1 hajm nisbatida boncuklar bilan bezatildi va muz ustida 5 daqiqa davomida sovutildi. Erimaydigan modda, sinmagan hujayralar va shisha boncuklar stol usti mikrosantrifugasida 16000 RCF da 10 daqiqa davomida santrifugalash orqali olib tashlandi. Membrana Ti 70.1 rotorida 100 000 RCF bilan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) da 40/15% (w/w) saxaroza gradiyenti bilan 10 soat davomida ajratildi.
Oldingi ishimizda tasvirlanganidek, PufW (16) da His yorlig'ining immunodetektsiyasi. Qisqasi, 2x SDS yuklash buferida (Merck, Buyuk Britaniya) bir xil konsentratsiyali RC ni o'z ichiga olgan tozalangan yadro kompleksi (11,8 nM) yoki membrana (oksidlanish orqali kamaytirilgan farq spektrini ayirish va bo'yalgan geldagi yukni moslashtirish orqali aniqlanadi) ikki marta suyultirildi. Oqsillar 12% bis-tris NuPage gelining replikasida (Thermo Fisher Scientific, Buyuk Britaniya) ajratildi. RC-L subbirligini yuklash va vizualizatsiya qilish uchun gel Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Buyuk Britaniya) bilan bo'yaldi. Ikkinchi geldagi oqsil immunoassay uchun metanol bilan faollashtirilgan poliviniliden ftorid (PVDF) membranasiga (Thermo Fisher Scientific, Buyuk Britaniya) o'tkazildi. PVDF membranasi 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 va 5% (w / v) yog'sizlantirilgan sut kukunida bloklandi va keyin anti-His birlamchi antitelosi bilan (Dlute the antitelo bufer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl va 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, AQSh) 4 soat davomida inkubatsiya qilindi. Antikor buferida 5 daqiqa davomida 3 marta yuvilgandan so'ng, membrana xren peroksidazasi (Sigma-Aldrich, Buyuk Britaniya) sichqonlarga qarshi ikkilamchi antikor (antikor buferida 1:10,000 suyultirilgan) bilan birlashtirildi. Aniqlash uchun (antikor buferida 3 marta yuvilgandan keyin 5 daqiqa) WESTAR ETA C 2.0 xemilyuminesensiya substrati (Cyanagen, Italiya) va Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Buyuk Britaniya) yordamida inkubatsiya qilindi.
ImageJ (57) da har bir bo'yalgan gel yoki immunoassay chizig'ining intensivlik taqsimotini chizish, cho'qqi ostidagi maydonni integrallash va RC-L (bo'yalgan gel) va Protein-W (immunoassay) intensivlik nisbatini hisoblash orqali tasvirni qayta ishlang. Bu nisbatlar sof RC-LH114-W namunasida RC-L ning protein-W ga nisbati 1:1 deb taxmin qilish va shunga mos ravishda butun ma'lumotlar to'plamini normallashtirish orqali molar nisbatlarga aylantirildi.
Ushbu maqola uchun qo'shimcha materiallar uchun http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ga qarang.
Bu Creative Commons Attribution litsenziyasi shartlari asosida tarqatiladigan ochiq kirish huquqiga ega maqola. Asl asar to'g'ri iqtibos keltirilgan taqdirda, maqola har qanday vositada cheklovsiz foydalanish, tarqatish va ko'paytirishga ruxsat beradi.
Eslatma: Sizdan faqat elektron pochta manzilingizni taqdim etishingizni so'raymiz, shunda sahifaga tavsiya qilgan odam siz elektron pochtani ko'rishini xohlayotganingizni va u spam emasligini biladi. Biz hech qanday elektron pochta manzillarini yozib olmaymiz.
Bu savol sizning tashrif buyuruvchi ekanligingizni tekshirish va avtomatik spam yuborishning oldini olish uchun ishlatiladi.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaksiya markazidagi 1-yorug'lik tuzog'i kompleksining yuqori aniqlikdagi tuzilishi xinon dinamikasi haqida yangi tushunchalar beradi.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaksiya markazidagi 1-yorug'lik tuzog'i kompleksining yuqori aniqlikdagi tuzilishi xinon dinamikasi haqida yangi tushunchalar beradi.
©2021 Amerika fan taraqqiyoti assotsiatsiyasi. barcha huquqlar himoyalangan. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef va COUNTER hamkori hisoblanadi. Science Advances ISSN 2375-2548.